禹紹周 林慧純 張書迪 張偉 黃水林 王維部 張碧松 盧運明

摘要 [目的]開發(fā)出有效的鮮活螺旋藻殺菌方法，以延長鮮活螺旋藻的保質(zhì)期，提升其感官和營養(yǎng)價值。[方法]將鮮活螺旋藻分散成懸浮液，用曝氣石將臭氧發(fā)生儀產(chǎn)生的臭氧通入懸浮液中，檢測懸浮液菌落總數(shù)隨通氣時間變化而變化的情況?？疾炝藨腋∫簼舛群腕w積對殺菌效果的影響，還考察了殺菌前后螺旋藻的形態(tài)變化。[結(jié)果]在同等體積下，螺旋藻濃度越小，殺菌效果越好;在同等濃度下，藻液體積小到一定程度之后，殺菌效果才有較為明顯的提升;臭氧基本不會對螺旋藻細胞結(jié)構(gòu)造成破壞。[結(jié)論]該研究開發(fā)的臭氧殺菌法是一個理想的鮮活螺旋藻殺菌選項。

關(guān)鍵詞 鮮活螺旋藻;臭氧;殺菌;細胞結(jié)構(gòu)

中圖分類號 S984.4+1文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0155-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.048

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research on Ozone Sterilization Effect of Fresh Spirulina

Abstract [Objective]Effective sterilization methods of fresh Spirulina were developed to prolong the shelf life and enhance its sensory and nutritional value. [Method]The fresh Spirulina was dispersed into a suspension， and the ozone generated by the ozone generator was introduced into the suspension by aeration stone to detect the change of the total number of suspension colonies with the change of the ventilation time.The effects of suspension concentration and volume on the bactericidal effect were investigated. The morphological changes of Spirulina before and after sterilization were also investigated.[Result]In the same volume， the smaller the concentration of Spirulina， the better the sterilization effect.At the same concentration， the bactericidal effect was significantly improved when Spirulina volume was small to a certain extent.Ozone didnt damage the cell structure of Spirulina.[Conclusion]The ozone sterilization method developed in this study is an ideal sterilization option for fresh Spirulina.

Key words Fresh Spirulina;Ozone;Sterilization;Cellular structure

基金項目 深圳市戰(zhàn)略新興和未來產(chǎn)業(yè)發(fā)展資金項目（2017050316 3617880）。

作者簡介 禹紹周（1977—），男，黑龍江哈爾濱人，農(nóng)藝師，從事食用農(nóng)產(chǎn)品藥物殘留檢測分析研究。*通信作者，博士，從事食品安全檢測與分析研究。

收稿日期 2019-04-22;修回日期 2019-05-06

螺旋藻的生存歷史非常悠久，在地球上已經(jīng)存在了35億年，是一種靠分裂增殖的光合自養(yǎng)型藍藻。它的營養(yǎng)價值很高，含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪酸、生物活性物質(zhì)等，幾乎包含了所有人體正常運轉(zhuǎn)所需要的營養(yǎng)素[1]。螺旋藻的蛋白質(zhì)占其干重的58.5%～83.4%[2]，比常見的肉類、蛋奶類和豆類都要高，而其氨基酸組成又非常符合人體對氨基酸的需求比例。螺旋藻的維生素含量高、種類多，可多達13種，以維生素B、維生素E、維生素K為主，此外還有藻藍素和β胡蘿卜素，而β胡蘿卜素又是合成維生素A必不可少的物質(zhì)。螺旋藻含有50多種不同的礦物質(zhì)，其中以碘、鉀、鈉、鎂等礦物質(zhì)為主。螺旋藻所含的脂肪中大多數(shù)都是對人體有益的不飽和脂肪酸，尤其是γ-亞麻酸，占其干重的1.1%[3] 。螺旋藻的細胞壁基本由肽聚糖組成，纖維素組成只占細胞壁的4%～5%，可以很容易地破壞細胞壁，其消化率高達76%[3]。除了以上常見營養(yǎng)物質(zhì)外，螺旋藻還含有各種生物活性物質(zhì)，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等，它們能夠有效地去除人體中的過氧化物和自由基，起到抗衰老、預防高血壓、心臟病等功能。由于螺旋藻卓絕的“食藥同源”特性，它被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）譽為“21世紀最佳理想食品”，也被世界衛(wèi)生組織評為“21世紀的最佳保健品”[4]。

雖然螺旋藻有著如上令人艷羨的營養(yǎng)價值，但是它也存在一些不足之處，那就是鮮活螺旋藻不易保存。剛剛采收的新鮮螺旋藻無不良氣味，但若將其放在室溫下（20 ℃），在一天之內(nèi)它就會因為微生物活動等原因變質(zhì)，細胞破裂后里面的蛋白質(zhì)等物質(zhì)被微生物分解后會產(chǎn)生令人不快的氣味。通常的應對辦法是將新鮮采收的螺旋藻進行脫水處理，包括自然晾干、低溫烘干、真空凍干、微波干燥、噴霧干燥等方法[5-6]，有的研究者還對干燥后的螺旋藻進行了輻照殺菌、臭氧殺菌等處理[7-8]，最后得出的產(chǎn)品為粉狀、片狀或者膠囊狀的制劑，雖然能夠保存較長的時間，但是其性狀對消費者而言不太具備吸引力，而且干燥會對螺旋藻中的營養(yǎng)物質(zhì)造成不同程度的損失，降低了其原本具有的營養(yǎng)價值[9-10]。在此背景下，開發(fā)一種能夠?qū)︴r活螺旋藻進行有效殺菌的辦法顯得至關(guān)重要，這樣既能保持螺旋藻原有的狀態(tài)和營養(yǎng)價值，又能延長螺旋藻的保質(zhì)期，為其進一步深加工運用等打下良好的基礎(chǔ)。筆者擬開發(fā)一種針對鮮活螺旋藻的臭氧殺菌方法，分別考察和討論了藻液濃度、藻液體積對殺菌效果的影響程度，并用顯微鏡檢查了殺菌前后螺旋藻細胞形態(tài)的變化，說明此鮮活螺旋藻臭氧殺菌方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

試驗所用胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂、氯化鈉等化學藥品均購自深圳銘科科技有限公司，所用超純水為實驗室超純水制備儀所產(chǎn)一級水，螺旋藻泥為實驗室自行設(shè)計的小型螺旋藻培養(yǎng)機上采收的藻泥，培養(yǎng)時采用標準Zarrouk培養(yǎng)基，采用間歇式光照和正壓鼓氣方式，將采收到的藻泥用自來水清洗3次到pH近7.0，暫不用到的藻泥放在-20 ℃下保存至試驗日。

無菌生理鹽水：稱取8.5 g氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，在121 ℃下高壓滅菌15 min。

瓊脂培養(yǎng)基：分別稱取適量胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂加入蒸餾水中，加熱煮沸溶解并調(diào)節(jié)pH至7.0左右，在121 ℃下高壓滅菌15 min。

1.2 設(shè)備

高壓滅菌鍋（MLS-3750，Sanyo）;電子天平（BSM2203，上海卓精電子科技有限公司）;恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082，上海一恒科學儀器有限公司）;菌落計數(shù)器（ALN-50S，上海昂尼儀器儀表有限公司）;臭氧消毒機（FL-802A，深圳市飛立電器科技有限公司）;多功能數(shù)碼液晶顯微鏡（US3，深圳市愛科學數(shù)碼科技有限公司），另外還有無菌吸管、50 mL離心試管、培養(yǎng)皿、臭氧曝氣石等。所有與藻液直接接觸的玻璃器皿、曝氣石等都事先在121 ℃下高壓滅菌并烘干處理。

1.3 方法

稱取200、100、50和20 g螺旋藻泥樣品，分別用1.0、1.0、0.5、0.2 L無菌生理鹽水配制成螺旋藻濃度為200、100、100、100 g/L藻液。將曝氣石與臭氧殺菌器上的出氣口用硅膠軟管相連，將曝氣石放入藻液中，開啟臭氧殺菌器通入臭氧進行滅菌，臭氧產(chǎn)量為2 g/h，滅菌時間分別為0、10、20、30、40、50和60 min，每到一個時間點后混勻藻液并從中取出1 mL的藻液待測。

將上述1 mL待測藻液加入到裝有9 mL無菌生理鹽水的無菌試管中，混勻后制備成1∶10稀釋的樣品均液。吸取1 mL上述稀釋后的均液于無菌培養(yǎng)皿中，并取15～20 mL無菌瓊脂培養(yǎng)基導入培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)動混勻，待其冷卻凝固后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，并在36 ℃下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出平板，并在菌落計數(shù)器上進行計數(shù)并進行最后的換算，結(jié)果取2次平行的平均值并計算出標準偏差。

2 結(jié)果與分析

考察了相同體積下的藻液濃度和相同濃度下的藻液體積對殺菌效果的影響。在第1次（200 g/L，1.0 L）、第2次（100 g/L，1.0 L）、第3次（100 g/L，0.5 L）和第4次（100 g/L，0.2 L）殺菌試驗下，菌落總數(shù)隨殺菌時間的增長變化情況如表1所示。

2.1 懸浮液濃度對殺菌效果的影響

將表1中第1次試驗（200 g/L，1.0 L）和第2次試驗（100 g/L，1.0 L）結(jié)果分別進行歸一化處理并將數(shù)據(jù)合并，得到圖1所示結(jié)果。從圖中可以看到，在殺菌40 min之前，臭氧對200 g/L藻液的殺菌效果和對100 g/L藻液的殺菌效果幾乎沒有差別，甚至高濃度藻液的殺菌效果還稍微好一點。在殺菌40～60 min時，100 g/L藻液的殺菌效果比200 g/L的要好，殺菌結(jié)束后200 g/L藻液的殺菌率只有74%，而100 g/L藻液的殺菌率接近90%，殺菌效果更好。這有可能是因為200 g/L藻液初始狀態(tài)下細菌密度更高，接觸到臭氧的概率更大，所以剛開始殺菌效果更好;而100 g/L藻液總體細菌數(shù)量更少，所以到最后時即使殺菌絕對數(shù)量比200 g/L藻液少，但殺菌率還是更高。

2.2 懸浮液體積對殺菌效果的影響

將表1中第2次試驗（100 g/L，1.0 L）、第2次試驗（100 g/L，0.5 L）和第3次試驗（100 g/L，0.2 L）結(jié)果分別進行歸一化處理并將數(shù)據(jù)合并，得到圖2所示結(jié)果。從圖中可以看到，1 L藻液的初期殺菌速度較快，結(jié)合“2.1”的觀察結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)一個規(guī)律，即初始細菌總數(shù)絕對值大的試樣初期殺菌效果更好。當殺菌超過30 min后，1.0 L和0.5 L的殺菌效率曲線開始重合并一直到殺菌結(jié)束;而殺菌10 min后，0.2 L藻液的殺菌效率開始遠遠超過

另外2份藻液，其最終殺菌率（94%）也比另外2份藻液高（90%、88%）。這可能是由于0.2 L藻液的體積較小，單位體積能夠溶解的臭氧含量更高，那么隨著臭氧通氣時間的增加藻液中臭氧濃度也逐漸高于另外2份藻液，殺菌效果自然也就更高。

2.3 殺菌對細胞結(jié)構(gòu)的影響

有些細胞在臭氧的作用下會破裂死亡或者產(chǎn)生其他不良影響。為了考察臭氧對螺旋藻細胞的影響，取殺菌前后（60 min）的藻液分別在40×和100×放大倍數(shù)下拍照，結(jié)果如圖3所示。不論是在40×還是100×放大倍數(shù)下觀測都可以看出，殺菌前后的螺旋藻細胞形態(tài)基本沒有變化，還保持著完整的細胞結(jié)構(gòu)和活性，即臭氧不會對螺旋藻造成嚴重的破壞。

3 結(jié)論

筆者考察了螺旋藻液濃度、體積對臭氧殺菌效果的影響，發(fā)現(xiàn)藻液中細菌總數(shù)絕對值越高，其殺菌初期的殺菌效果越好，這可能是初期細菌濃度較高，被臭氧殺死的概率也較高的原因;而當藻液體積下降到一定程度后，殺菌效果會顯著提升，這可能是因為液體體積小，單位體積上溶解的臭氧含量更高的緣故。最后，考察了臭氧殺菌對螺旋藻細胞的影響，發(fā)現(xiàn)螺旋藻對臭氧具有較強的抗性，臭氧不會對螺旋藻細胞結(jié)構(gòu)造成嚴重的破壞。所有上述結(jié)果表明該鮮活螺旋藻臭氧殺菌辦法是較為可行的。

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