馬銀鵬 包怡紅 張丕奇 韓增華 馬慶芳 張先成*

（1東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

黑木耳（Auricularia heimuer）[1]質(zhì)地滑嫩、清脆可口，是一種重要的食藥用菌[2]。近年來(lái)黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，對(duì)黑木耳菌種的需求越來(lái)越大，但黑木耳菌種市場(chǎng)“同物異名、同名異物”現(xiàn)象普遍存在（主要由于相互頻繁引種并自主命名造成），這給黑木耳品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)帶來(lái)了很大困難[3]。

為了保護(hù)黑木耳種質(zhì)資源知識(shí)產(chǎn)權(quán)，有必要了解生產(chǎn)上應(yīng)用黑木耳菌株規(guī)范性，并對(duì)黑木耳菌株進(jìn)行區(qū)別性鑒定[4]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記被應(yīng)用到菌株區(qū)別性鑒定中。ISSR（Intersimple Sequence Repeat）是一種簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記[5]，具有豐富的擴(kuò)增多態(tài)性，并具有快速、簡(jiǎn)便、可靠等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用到種質(zhì)資源鑒定、遺傳作圖、系統(tǒng)發(fā)育、分子標(biāo)記育種等方面[6]。劉華晶等[7]利用PCR-ISSR體系，選出9個(gè)ISSR引物，通過(guò)聚類分析成功分析了黑龍江省33個(gè)野生木耳菌株和8個(gè)栽培菌株的遺傳多樣性。任廣明等[8]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了黑龍江省伊春地區(qū)23個(gè)黑木耳主栽品種DNA指紋圖譜。

筆者采用ISSR分子標(biāo)記方法對(duì)來(lái)自黑龍江東寧縣不同單位黑木耳菌株進(jìn)行區(qū)別性鑒定，以評(píng)價(jià)黑木耳菌種市場(chǎng)的規(guī)范化程度。

1 材料與方法

1.1 供試菌株來(lái)源

選取2017年春季黑龍江省東寧縣兩個(gè)黑木耳主栽品種，分別以黑木耳1號(hào)和黑木耳2號(hào)取代市場(chǎng)真實(shí)商品名，采集東寧縣不同地域（單位）的黑木耳菌株共30株，利用cPDA培養(yǎng)基分離純化30株黑木耳菌株，經(jīng)5次純化后，28株黑木耳菌株無(wú)性狀分離，形態(tài)特性均一穩(wěn)定。根據(jù)菌絲形態(tài)特征和對(duì)峙試驗(yàn)并結(jié)合地區(qū)代表性，篩選出10個(gè)黑木耳菌株進(jìn)行ISSR研究（表1）。上述菌株均保藏于黑龍江省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 菌絲體培養(yǎng)及總DNA提取

將純化后的菌株接入250 mL三角瓶PD培養(yǎng)基中，25℃條件下120 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，9391×g離心收集菌絲體，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎酶倪M(jìn)的CTAB法提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品總DNA質(zhì)量，紫外分光光度法檢測(cè)樣品總DNA濃度，稀釋到相應(yīng)濃度后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR-PCR擴(kuò)增

根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）設(shè)計(jì)的ISSR引物，選擇10個(gè)多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反應(yīng)體系：10 μL 2×Tap Mix（納川），1 μL引物（0.5 μmol/L），1 μL 總 DNA（50 ng/μL），ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30 s，相應(yīng)退火溫度退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。每條引物重復(fù)擴(kuò)增3次，篩選出多態(tài)性高、重復(fù)性好的擴(kuò)增圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 供試黑木耳菌株

表2 ISSR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

比對(duì)和校正ISSR擴(kuò)增圖譜，對(duì)于同一條引物的擴(kuò)增圖譜，遷移率相同的條帶記為一個(gè)位點(diǎn)，擴(kuò)增陽(yáng)性賦值為“1”，擴(kuò)增陰性賦值為“0”，構(gòu)建初始0/1數(shù)據(jù)矩陣。采用NTsys_2.02軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，基于UPGMA方法構(gòu)建聚類圖譜并進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA（圖1），紫外分光光度法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A260與A280比值為1.86，因此，提取到的總DNA可用于ISSR分析。

圖1 基因組DNA檢測(cè)圖譜

ISSR-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)：從10條引物中篩選出7條引物（引物1、引物2、引物3、引物4、引物7、引物8和引物9）擴(kuò)增條帶具有多態(tài)性。擴(kuò)增條帶大小為300～4000 bp。7條擴(kuò)增具有多態(tài)性的引物共擴(kuò)增出25種條帶，其中7種條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為28%。

圖2 引物7瓊脂糖凝膠電泳圖譜

表3 10株黑木耳菌株遺傳相似系數(shù)

利用NTsys_2.02軟件對(duì)10株黑木耳菌株進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10株黑木耳菌株遺傳相似系數(shù)為0.72～1（表3）。用NTsys_2.02軟件基于UPGMA方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖3）。10株黑木耳菌株的遺傳相似性較高，在相似系數(shù)為0.88處將供試樣本分為兩大類群。黑木耳1號(hào)中的1、2-2、5、11、12、23和黑木耳2號(hào)中的15、20共計(jì)8個(gè)黑木耳菌株聚為一類，遺傳相似系數(shù)為1，此8株黑木耳菌株為同一個(gè)黑木耳品種。黑木耳1號(hào)中的8-1和22兩個(gè)黑木耳菌株聚為一類，遺傳相似系數(shù)為0.88，這兩個(gè)菌株與其他8株黑木耳菌株可能為不同的黑木耳品種。

圖3UPGMA聚類分析圖譜

3 小結(jié)與討論

采用對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行黑木耳區(qū)別性鑒定，操作方便、成本低，且鑒定結(jié)果易于觀察[9]。拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10株黑木耳菌株中8-1、22與其他菌株形成溝壑型拮抗線，但是拮抗線不明顯。因此，通過(guò)拮抗試驗(yàn)較難判斷8-1與22為不同黑木耳品種，需要結(jié)合細(xì)胞學(xué)、生化和DNA水平對(duì)黑木耳菌株進(jìn)行區(qū)別性鑒定。

ISSR分子標(biāo)記從DNA水平檢測(cè)基因組DNA多態(tài)性，受環(huán)境條件影響很小，可有效鑒定不同黑木耳栽培品種[10]。利用ISSR分子標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)黑木耳2號(hào)中的15、20菌株與其他6個(gè)黑木耳1號(hào)菌株聚為一類，這8株菌株為同一黑木耳品種，因此黑木耳菌種市場(chǎng)存在同物異名現(xiàn)象。黑木耳1號(hào)中的8-1和22兩個(gè)菌株聚為一類，與其他8株黑木耳菌株可能為不同的黑木耳品種，因此黑木耳菌種市場(chǎng)存在同名異物現(xiàn)象。這表明黑木耳菌種引種、命名相對(duì)混亂，給黑木耳品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)、菌種質(zhì)量管理和品種審定帶來(lái)了很大的困難。品種是豐產(chǎn)的根本，種源不清晰、品種不純正等可能會(huì)造成減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重影響黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此亟須規(guī)范菌種市場(chǎng)。

王晗等[12]通過(guò)酯酶同工酶鑒定不同地區(qū)引種的黑木耳菌株，結(jié)果將10個(gè)菌株分為3個(gè)組群。筆者研究結(jié)果與其基本一致，因此，ISSR分子標(biāo)記可以作為一種有效的黑木耳菌株區(qū)別性鑒定的方法。其他分子標(biāo)記如SSR[13-14]和SRAP[15-16]等也已被應(yīng)用到品種區(qū)別性鑒定中，后續(xù)需采用多種分子標(biāo)記相結(jié)合的方法共同鑒定不同地區(qū)引種的黑木耳菌株。