朱容慧 李巍

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海 200040

生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的進(jìn)展在一定程度上得益于新技術(shù)、新方法的進(jìn)步。單細(xì)胞RNA測序技術(shù)能夠在單細(xì)胞層面對基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，是研究皮膚生理功能和疾病狀態(tài)的新手段。這一技術(shù)的應(yīng)用有望從轉(zhuǎn)錄組水平重新定義多種皮膚疾病亞型，揭示新的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和開發(fā)新的治療策略，具有非常重要的意義。目前單細(xì)胞RNA測序在皮膚病領(lǐng)域的應(yīng)用剛剛開始，本文主要介紹單細(xì)胞RNA測序的原理、技術(shù)流程及其在皮膚病研究中的初步應(yīng)用，為廣大皮膚科臨床和科研工作者了解并應(yīng)用這一技術(shù)提供參考。

一、單細(xì)胞RNA測序技術(shù)簡介

RNA 測序技術(shù)是檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的可靠方法，高通量RNA測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的諸多研究當(dāng)中，但普通RNA測序是在組織樣本或細(xì)胞群水平上進(jìn)行的，單個(gè)細(xì)胞之間的生物學(xué)差異可能被平均，或被誤認(rèn)為技術(shù)噪音而掩蓋［1］，為了克服這一缺陷，人們研發(fā)了單細(xì)胞RNA測序技術(shù)。該技術(shù)是在單細(xì)胞水平上對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，可揭示細(xì)胞間的變異和群體的異質(zhì)性，特別適合發(fā)現(xiàn)罕見的細(xì)胞群體，為那些數(shù)量少的細(xì)胞群體如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞提供了有效的研究方法［2］。單細(xì)胞RNA測序技術(shù)在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方面也有良好的應(yīng)用前景，可以區(qū)分出對藥物敏感的細(xì)胞和非敏感細(xì)胞，指導(dǎo)治療的選擇和藥物的開發(fā)［3］。2013年這項(xiàng)技術(shù)被Nature Method雜志評選為年度技術(shù)，并在過去幾年間在胚胎發(fā)育、癌癥生物學(xué)和免疫學(xué)方面取得了一系列創(chuàng)新性成果［4］。

二、單細(xì)胞RNA測序的技術(shù)流程

單細(xì)胞RNA 測序技術(shù)與其他RNA 測序的基本原理相似，流程包括細(xì)胞制備、文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)分析，見圖1。其中單細(xì)胞制備和單細(xì)胞文庫構(gòu)建是最重要的環(huán)節(jié)，決定了數(shù)據(jù)質(zhì)量、測序通量、精確度、靈敏度和可重復(fù)性［5］。

單細(xì)胞的分離制備技術(shù)目前主要有流式細(xì)胞分選術(shù)、免疫磁珠細(xì)胞分選技術(shù)、顯微操作法、微流控技術(shù)、梯度稀釋法、激光捕獲顯微切割技術(shù)等，比較常用的是前4種。

流式細(xì)胞分選技術(shù)［6］是對單細(xì)胞懸液預(yù)先用熒光標(biāo)記細(xì)胞表面特異性分子，利用細(xì)胞結(jié)合的熒光標(biāo)記或細(xì)胞本身的光散特性，高效、快捷地從大量細(xì)胞中分選出特定的細(xì)胞，適用于大樣本中特定細(xì)胞類型的分選。但是，該技術(shù)對樣本制備、儀器操作要求較高，而且這種方法對細(xì)胞機(jī)械損傷較大，需要盡快進(jìn)行下一步操作。

圖1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序流程

磁珠分選［7］是預(yù)先對單細(xì)胞懸液中的細(xì)胞進(jìn)行特異性磁性標(biāo)記，經(jīng)穩(wěn)定磁場中的分選柱洗脫后篩選出標(biāo)記細(xì)胞，對細(xì)胞刺激小，細(xì)胞活性高，技術(shù)操作簡單。但是，分選純度只在80%～90%之間，而且每次操作只能分為標(biāo)記和未標(biāo)記兩群細(xì)胞，不能進(jìn)行多參數(shù)的分群。

顯微操作法［8］是在顯微鏡視野下直接對固體的組織進(jìn)行單細(xì)胞分離，優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)行可視化操作，耗材較低，適用于較小的細(xì)胞群體中目標(biāo)細(xì)胞的分離。但是該技術(shù)操作難度因操作者和組織細(xì)胞而異，分離通量也較小。

微流控技術(shù)［9］是利用流控通道具備的功能，如通道可調(diào)節(jié)的直徑（10～100 μm）和功能性修飾（如捕獲分子、抗體、電極等），人為地控制液體流動(dòng)來進(jìn)行細(xì)胞分選，如C1?單細(xì)胞全自動(dòng)制備系統(tǒng)，只需要將細(xì)胞樣品加在C1?微流體芯片上，輸入指令，該系統(tǒng)就會(huì)快速自動(dòng)分離出96 或384個(gè)單細(xì)胞并分配到單個(gè)制備倉中，之后系統(tǒng)還會(huì)自動(dòng)地裂解、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、檢測和分析細(xì)胞，在實(shí)現(xiàn)大通量的同時(shí)免除了繁重的加樣和混合步驟，大大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低了操作帶來的實(shí)驗(yàn)誤差。但是該系統(tǒng)要求大量具有高度均一性的樣本細(xì)胞，限制了對數(shù)量稀少或者異質(zhì)性高的細(xì)胞的研究，而且設(shè)備昂貴，成本較高。

死細(xì)胞釋放的游離RNA 會(huì)影響單細(xì)胞RNA 數(shù)據(jù)的質(zhì)量，因此在制備單細(xì)胞時(shí)最重要的是保持細(xì)胞的活力。在選擇方法時(shí)，主要是針對組織和細(xì)胞的性質(zhì)選擇對細(xì)胞損傷盡可能小的方式進(jìn)行操作。除了方法本身對細(xì)胞可能帶來的損傷外，移液、振蕩、離心、細(xì)胞所處的溫度和基質(zhì)都會(huì)對細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，所以應(yīng)該綜合考慮各種因素，選擇對保持細(xì)胞活力最優(yōu)的方案，盡可能提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

單細(xì)胞文庫的構(gòu)建方法早期主要分為兩種：一種是將單細(xì)胞分離后置于96 孔板中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后加上PCR 擴(kuò)增的接頭和細(xì)胞識(shí)別條形碼，轉(zhuǎn)移到單個(gè)管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；谶@種方法的技術(shù)有單細(xì)胞標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄測序（single-cell tagged reverse transcription sequencing，STRT-seq）［10］、Smart 測序技術(shù)（switching mechanism at 5′end of RNA template，Smart-seq）［11］、改良 Smart 測序技術(shù)（Smart-seq2）［12］等，這種方法覆蓋度較好，但一次能測序的細(xì)胞數(shù)少，步驟繁瑣。另一種方法是在反轉(zhuǎn)錄的引物上加上細(xì)胞條形碼對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，第二鏈合成后，將所有反應(yīng)管的cDNA混合，利用體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)行線性擴(kuò)增［13］。這種方法包括線性擴(kuò)增測序（cell expression by linear amplification and sequencing，CEL-seq）［13］、改良線性擴(kuò)增測序（CEL-seq2）［14］、高通量平行擴(kuò)增測序（massively parallel single-cell RNA sequencing，MARS-seq）［15］等。但這兩種方法都是利用96 孔板或384 孔板為操作平臺(tái)，由于孔數(shù)的局限，限制了單細(xì)胞RNA測序規(guī)模的擴(kuò)大。2015年哈佛醫(yī)學(xué)院Steven McCarroll研究團(tuán)隊(duì)利用微流控技術(shù)開發(fā)液滴測序（Droplet sequencing ，Drop-seq），將帶有條形碼引物的微珠和細(xì)胞在油乳劑中壓縮為一個(gè)液滴，在液滴中進(jìn)行建庫，由此檢測數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞［15-17］。這種技術(shù)可以大量無偏倚地挑選細(xì)胞進(jìn)行測序，極大提高了實(shí)驗(yàn)的通量，同時(shí)也不需要細(xì)胞具有較高的均一性，但這種方法覆蓋率比較低，在單個(gè)細(xì)胞中檢測到的轉(zhuǎn)錄組只有其他方法的一半［18］?；贒ropseq，10X Genomics 公司和 Fred Hutch 的團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一套新的技術(shù)并且商業(yè)化推廣，可在6 min 內(nèi)完成擴(kuò)增測序，能夠同時(shí)分析來自29 個(gè)不同樣品的250 000 個(gè)單細(xì)胞，大大加速了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究［19］。2018年浙江大學(xué)Han等［20］研發(fā)微孔測序技術(shù)（Microwell-Seq），利用磁珠將細(xì)胞吸附在用瓊脂構(gòu)建的微孔陣列中，再加入條形碼微珠進(jìn)行測序，一次可以測序＞400 000個(gè)單細(xì)胞，這種方法顯著提升了測序通量，又保證了靈敏度，降低了測序成本。

三、單細(xì)胞RNA測序在皮膚病學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

目前在皮膚相關(guān)領(lǐng)域使用單細(xì)胞RNA 測序技術(shù)的研究較少。Joost等［21］首先利用這種技術(shù)研究了小鼠正常皮膚表皮的結(jié)構(gòu)和組成，對小鼠毛囊間和毛囊的表皮細(xì)胞進(jìn)行測序，得到1 422 個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)，根據(jù)細(xì)胞群標(biāo)志性基因區(qū)分出25群不同種類的細(xì)胞，例如，將高表達(dá)Scd1/Mgst1的細(xì)胞劃分為皮脂腺細(xì)胞，以Krt6a/Krt75、CD34/Postn 標(biāo)記內(nèi)、外根鞘角質(zhì)形成細(xì)胞，分別用CD207 和CD3 標(biāo)記朗格漢斯細(xì)胞和T細(xì)胞這兩個(gè)免疫細(xì)胞群。研究者使用免疫組化和單分子熒光原位雜交技術(shù)分別從蛋白水平和組織水平驗(yàn)證細(xì)胞分群的存在，同時(shí)對細(xì)胞分群進(jìn)行空間定位，將角質(zhì)形成細(xì)胞從基因表達(dá)和空間位置上分為更詳細(xì)的亞類。他們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在不同空間位置的表皮干細(xì)胞有共同的基底-表皮基因表達(dá)模式。該研究顯示了單細(xì)胞RNA 測序技術(shù)在識(shí)別皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞亞群上的強(qiáng)大能力。

Cheng等［22］利用單細(xì)胞RNA測序技術(shù)分析正常人體不同部位表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的基因特征以及銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞基因表達(dá)的變化。該實(shí)驗(yàn)獲取9 例正常人和3 例銀屑病患者的頭皮、軀干和包皮3個(gè)不同部位的皮膚組織，獲得92 889 個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)。將這些數(shù)據(jù)混合分析后發(fā)現(xiàn)，將這些數(shù)據(jù)混合分析后發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄組水平，不同解剖部位的角質(zhì)形成細(xì)胞不僅在組織學(xué)上分為不同的亞群，也在細(xì)胞執(zhí)行的功能上分為不同的亞群，比如執(zhí)行細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)功能的亞群、與炎癥反應(yīng)相關(guān)的亞群和與WNT信號(hào)通路調(diào)控有關(guān)的亞群。此外這項(xiàng)研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)表皮在轉(zhuǎn)錄組水平上的一些炎性特征：①正常頭皮部位角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中存在固有的炎癥表達(dá)模式，即毛囊間角質(zhì)形成細(xì)胞S100分子活化；②正常包皮的表皮免疫細(xì)胞中存在一群其他部位表皮中沒有的IL1βhiCCL3hiCD14+巨噬細(xì)胞，提示在泌尿道表皮中有與這群細(xì)胞相關(guān)的特殊炎癥反應(yīng)；③銀屑病患者皮損中有大量CD1C+CD301+的髓樣樹突細(xì)胞的富集。該研究在mRNA 水平展示了正常人包皮、頭皮和軀干部位的表皮以及銀屑病患者的表皮細(xì)胞基因表達(dá)狀態(tài)，為進(jìn)一步研究更深層次的相關(guān)問題，尤其是關(guān)于基底層角質(zhì)形成細(xì)胞執(zhí)行不同分化程序的能力以及免疫細(xì)胞向銀屑病皮損部位的募集過程奠定了重要基礎(chǔ)。

Kobayashi 等［23］對表皮、真皮和皮下組織的固有淋巴樣細(xì)胞（innate lymphoid cells，ILC）進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，分別得到3 431、3 356、1 061 個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ILC 在皮膚的這3 個(gè)部位有特異性的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜。其中，皮下組織處的ILC表現(xiàn)出ILC2的轉(zhuǎn)錄特征，在真皮和表皮的ILC又各分為兩群，真皮部位的兩群細(xì)胞可能分別執(zhí)行不同的功能，而表皮的兩群可能表現(xiàn)了兩種不同的細(xì)胞激活狀態(tài)。ILC 在不同部位的分群與上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與趨化因子有關(guān)。這部分研究說明,不同組織部位的特有信號(hào)促進(jìn)皮膚ILC 的增殖，誘導(dǎo)不同的基因表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，他們研究毛囊皮脂腺附近的RORgt+ILC，發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞可能參與毛囊-皮脂單位的調(diào)節(jié)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),表皮ILC 可以通過抑制Notch信號(hào)通路限制皮脂腺細(xì)胞的生長，可能影響皮膚表面具有抗菌活性的游離脂肪酸的分泌，從而限制革蘭陽性菌的共生。該研究通過單細(xì)胞RNA 測序?yàn)檠芯科つw稀有的免疫細(xì)胞提供了技術(shù)可能，進(jìn)一步探究了皮膚免疫細(xì)胞與皮脂腺、共生菌群的關(guān)系，為皮膚免疫細(xì)胞如何調(diào)節(jié)皮膚穩(wěn)態(tài)提供了新的思路。

單細(xì)胞RNA 測序技術(shù)是研究腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境組成的強(qiáng)有力工具，已在乳腺癌［24］、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［25］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［26］等疾病中得到了應(yīng)用。Tirosh等［27］獲取了19 例黑素瘤患者腫瘤組織中4 645 個(gè)單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞的聚類顯示了腫瘤細(xì)胞間與細(xì)胞周期、空間環(huán)境和耐藥性相關(guān)的異質(zhì)性；小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）基因簇高表達(dá)或AXL受體酪氨酸激酶（AXL）基因簇高表達(dá)的細(xì)胞群體受到特別關(guān)注，因?yàn)檫@兩個(gè)基因簇的表達(dá)可能對黑素瘤細(xì)胞的存活和耐藥性至關(guān)重要。該研究顯示,所有的腫瘤細(xì)胞都可以分為MITF 高表達(dá)和MITF 低表達(dá)/AXL 高表達(dá)的兩個(gè)群，同時(shí)在MITF高表達(dá)群中發(fā)現(xiàn)了AXL高表達(dá)的黑素瘤細(xì)胞亞群。研究者同時(shí)對腫瘤內(nèi)的非惡性細(xì)胞進(jìn)行聚類分析，解析了腫瘤微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境中存在多種T細(xì)胞抑制性受體基因的表達(dá)，如程序性死亡分子1、T細(xì)胞免疫球蛋白與免疫受體酪氨酸抑制分子、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3、淋巴細(xì)胞活化分子3和細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)蛋白4等，抑制性受體基因的表達(dá)和T細(xì)胞活化狀態(tài)高度相關(guān)，提示黑素瘤中存在共刺激分子激活的T 細(xì)胞衰竭機(jī)制，可以作為免疫治療的靶點(diǎn)。該研究結(jié)果對黑素瘤的分型和腫瘤的精準(zhǔn)治療具有重要的指導(dǎo)意義，而這些結(jié)果無法通過普通高通量RNA測序得到，證明單細(xì)胞RNA測序在研究腫瘤亞群和腫瘤微環(huán)境中具有無可比擬的作用。

四、研究前景展望

對于正常皮膚，利用單細(xì)胞RNA測序技術(shù)可能會(huì)發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下以前未定義的皮膚細(xì)胞亞群，包括角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、樹突細(xì)胞和T 細(xì)胞等，這些新亞群可能在維護(hù)皮膚穩(wěn)態(tài)、發(fā)揮其屏障功能中起到不同的作用，通過這些發(fā)現(xiàn)從而獲得對皮膚生物學(xué)功能更全面的理解。對于炎癥性和自身免疫性皮膚病，如銀屑病、特應(yīng)性皮炎、白癜風(fēng)、紅斑狼瘡和大皰性皮膚病等，通過單細(xì)胞RNA測序可能會(huì)找到在發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用的靶細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)展相關(guān)的新的免疫細(xì)胞亞群，包括自身反應(yīng)性T細(xì)胞或B細(xì)胞等，從而能更準(zhǔn)確地定義疾病的特征，對疾病狀態(tài)有更精準(zhǔn)的分型；對于關(guān)鍵的免疫細(xì)胞，還可以捕捉不同分化階段的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序分析，重建細(xì)胞“decision making”的關(guān)鍵點(diǎn)和生長分化的過程，從而了解從健康向疾病轉(zhuǎn)換過程中免疫細(xì)胞如何分化，如T細(xì)胞向輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化。對于皮膚腫瘤，如鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤和黑素瘤，單細(xì)胞RNA測序?qū)椭覀冏R(shí)別新的皮膚腫瘤亞型和腫瘤浸潤細(xì)胞，為新的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)提供線索。此外，在全長單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)中，還可以讀到成對或全長的T細(xì)胞受體/B細(xì)胞受體序列［28］，將計(jì)算機(jī)重建的T細(xì)胞受體或B細(xì)胞受體信息與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合，可以確定與皮膚腫瘤和自身免疫性疾病相關(guān)的腫瘤特異性抗原和自身抗原。利用單細(xì)胞RNA 測序揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，最重要的是可以為皮膚疾病的治療提供新方案，如根據(jù)腫瘤特異性抗原或自身抗原開發(fā)嵌合抗體；通過識(shí)別對藥物敏感的細(xì)胞亞群的特征設(shè)計(jì)更敏感的靶向藥物；針對疾病的不同亞型采取對應(yīng)的治療方案等。

然而目前單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)還存在一些問題，除了通量和成本的限制，數(shù)據(jù)處理也是一個(gè)挑戰(zhàn)，例如如何用復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)判斷單個(gè)細(xì)胞的類型、定義不同的細(xì)胞亞群，怎樣挖掘出細(xì)胞群體與功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組特征，從而在分子水平給細(xì)胞群體的生物學(xué)功能做出更完整的描述。隨著單細(xì)胞研究浪潮的來臨，未來單細(xì)胞測序領(lǐng)域會(huì)得到極速的發(fā)展，相信更多的局限也將被突破。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突