張卉 祖淑靜 張寧 單飛 楊威

(哈爾濱市紅十字中心醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

稽留流產(chǎn)又稱過期流產(chǎn)，指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內(nèi)未及時(shí)自然排出者。胚胎或胎兒染色體異常是早期流產(chǎn)最常見的原因，約占50%～60%，染色體異常包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。其中數(shù)目異常以三體綜合征居多，常見的有13、18、21、16和22-三體，其次為X單體，三倍體和四倍體少見。結(jié)構(gòu)異常引起流產(chǎn)并不常見，主要有平衡易位、倒置、缺失、重疊及嵌合體等[1]。

染色體拷貝數(shù)變異測序(copy number varaition sequencing,CNV-seq)是采用高通量測序(next generation seqencing,NGS)技術(shù)對樣本DNA進(jìn)行低深度全基因組測序，將測序結(jié)果與人類參考基因組堿基序列進(jìn)行對比，通過生物信息分析發(fā)現(xiàn)樣本存在的拷貝數(shù)變異(CNVs)。具有流程簡單、易操作、通量高、兼容性好、所需DNA樣本量低等優(yōu)點(diǎn)，樣本可為外周血、羊水、臍血、絨毛組織等[2]。為臨床檢測染色體疾病提供新的解決手段，可發(fā)現(xiàn)染色體非整倍體及染色體微缺失/微重復(fù)等。CNV-seq技術(shù)可用于產(chǎn)前診斷、流產(chǎn)原因排查、不孕不育原因查找，以及疑似染色體疾病患者的染色體異常檢測。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月至2019年3月在哈爾濱市紅十字中心醫(yī)院婦產(chǎn)科門診臨床診斷的224例稽留流產(chǎn)患者，患者身體健康狀況良好，單胎。經(jīng)產(chǎn)前診斷門診遺傳咨詢自愿接受流產(chǎn)病因?qū)W檢測的患者，進(jìn)行檢測前咨詢，告知CNV-seq技術(shù)檢測目的及意義，行人工流產(chǎn)時(shí)留取絨毛組織送檢行CNV-seq。年齡在20～42歲，孕齡12周內(nèi)的患者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本的采集對臨床明確稽留流產(chǎn)的患者夫婦進(jìn)行檢測前的遺傳咨詢并簽署知情同意書。收集稽留流產(chǎn)患者的絨毛組織(無菌操作，無污染)取50～100g，放入生理鹽水中多次漂洗，漂洗至無血液成分，取黃豆粒大小的絨毛組織放入PE管密封管內(nèi)，及時(shí)送檢。

1.2.2 將采集到標(biāo)本送檢至北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司。

1.3 CNV-seq實(shí)驗(yàn)方案及流程圖，詳見表1、圖1.

表1 CNV-seq技術(shù)實(shí)驗(yàn)方案

圖1 CNV-seq實(shí)驗(yàn)流程圖

1 4 數(shù)據(jù)分析把檢測的DNA序列數(shù)據(jù)和基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到樣本中每條染色體上可比對的唯一序列含量，根據(jù)生物信息學(xué)分析，計(jì)算出每條染色體的覆蓋深度值，并轉(zhuǎn)化為衡量染色體異常風(fēng)險(xiǎn)的指數(shù)。樣本中某一染色體DNA(chr N)所占總DNA比例可以表示為覆蓋深度Cov-chr N。然后對深度進(jìn)行修正，通過樣本染色體的Cov-ratio來判斷胎兒染色體拷貝數(shù)是否異常，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的值為Cov-ratio值，Cov-chr N以及Cov-ratio值計(jì)算如下：覆蓋深度Cov-chr N=樣本染色體N上唯一序列片段總數(shù)/參考序列染色體N上唯一序列片段總數(shù)；樣本的chr N的Cov-ratio=chrN的修正深度/平均修正深度；樣本的Cov-ratio值>1.3判定為樣本染色體重復(fù)，Cov-ratio值<0.7判定為樣本染色體缺失。

2 結(jié)果

2.1 CNV-seq結(jié)果 224例稽留流產(chǎn)絨毛組織，檢測出染色體畸變114例，其中陽性檢出率為51%(114/244) ，其中數(shù)目異常71例，占31.70%，其中包括特納綜合征20例、16-三體19例、22-三體7例、21-三體6例、13-三體3例、14-三體2例、20-三體1例、18-三體1例、15-三體1例、8-三體1例、4-三體1例、三倍體8例。詳見表2。

表2 CNV-seq陽性結(jié)果(染色體數(shù)目異常)

2.2 CNV-seq結(jié)果根據(jù)測序及統(tǒng)計(jì)每條染色體的唯一序列片段所得出的結(jié)果分析，CNV-seq發(fā)現(xiàn)染色體畸變陽性率為51%(114/224)，單純數(shù)目異常為31.70%(71/224)，嵌合體為3.12%(7/224)，其它染色體畸變包含微缺失/微重復(fù)為16.07%(36/2224)。臨床意義不明的拷貝數(shù)目變異(Copy number variants of uncertain significance，VUS)，即未確定性質(zhì)的已報(bào)道DNA異?；蛭匆妶?bào)道的新變異，尚不能確定與其表型意義可能與稽留流產(chǎn)有無關(guān)系。詳見表3。

表3 CNV-seq陽性結(jié)果(染色體畸變除去數(shù)目異常以外嵌合體、部分微缺失/微重復(fù))

注：高通量測序DNA測序查詢的數(shù)據(jù)庫：DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共數(shù)據(jù)庫資源。

3 討論

3.1 稽留流產(chǎn)是胚胎停止發(fā)育未及時(shí)排除體外胚胎停止發(fā)育的主要原因之一是胚胎染色體異常，導(dǎo)致染色體異常的原因目前無明確定論，高齡是高危因素，與環(huán)境、感染、免疫、不良因素也有相關(guān)性。檢測胚胎染色體異常的方法有染色體核型分析、熒光原位雜交(FISH)、高通量DNA測序等技術(shù)。染色體核型分析常用G顯帶技術(shù)能夠檢查出絕大多數(shù)的染色體的異常情況，包括染色體數(shù)目異常如三體型、單體型、多倍體，染色體結(jié)構(gòu)異常如易位、倒位及10Mb以上的片段缺失、重復(fù)等。染色體核型分析應(yīng)用范圍廣、應(yīng)用時(shí)間較長，檢測結(jié)果比較受臨床醫(yī)師信賴，是對絨毛、羊水或臍血進(jìn)行產(chǎn)前診斷的主要方法和金標(biāo)準(zhǔn)。染色體核型分析技術(shù)檢測流產(chǎn)絨毛組織染色體的研究已經(jīng)比較深入。在國外，早在1975年就有學(xué)者報(bào)道了1500例自然流產(chǎn)組織樣本之后發(fā)現(xiàn)約有60%的絨毛染色體數(shù)目異常，主要為非整倍體和多倍體[3]。國內(nèi)學(xué)者們在染色體核型分析技術(shù)檢測絨毛染色體方面也做了大量研究：歐陽魯平等[4]利用傳統(tǒng)核型分析技術(shù)檢測了1160例早孕期流產(chǎn)絨毛樣本，檢測成功1140例，檢測成功率為98.2%，檢測出62例染色體異常核型，占5.44%，其中數(shù)目異常共32例(51.6%)，以45,X最多見，共 15例，其次是13-三體6例，結(jié)構(gòu)異常5例，嵌合體22例。本研究對224例稽留流產(chǎn)絨毛組織進(jìn)行CNV-seq檢測，共檢測出71例數(shù)目異常，45,X最多見,共20例，16-三體19例，22-三體7例也是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要原因，這與孫義錫[5]的研究結(jié)果一致。與歐陽魯平等[4]研究結(jié)果相近。CNV-seq比較核型分析技術(shù)，對檢測標(biāo)本要求較低，分辨率及檢測成功率高，成為快捷、準(zhǔn)確、靈活的新型檢測手段[6]。隨著高通量測序技術(shù)的成熟與發(fā)展，全基因組測序被應(yīng)用到各種領(lǐng)域，尤其是遺傳性疾病的研究方面?zhèn)涫荜P(guān)注。目前人類已知疾病中，大約有4000多種疾病與基因異常有關(guān)[7]。在傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)只能檢測5Mb以上的缺失和重復(fù)，5Mb以下隱藏著眾多的微小不平衡，是細(xì)胞遺傳學(xué)檢測難以診斷的。

3.2 FISH與傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù) FISH有著快速、高效等特點(diǎn)，但也存在一定的局限性。FISH技術(shù)現(xiàn)階段只能針對已知的染色體非整倍體異常進(jìn)行檢測，根據(jù)目前的研究，三體型可發(fā)生在除了1號(hào)染色體以外所有的染色體，而目前在臨床上使用的FISH探針只涉及13、16、18、21、22、X和Y這7條染色體，不能覆蓋所有染色體組，這將會(huì)漏診和誤診。臨床常用21、18、13、X、Y 五條探針。FISH技術(shù)只能檢測染色體的數(shù)目異常，并不能對染色體結(jié)構(gòu)異常進(jìn)行檢測。也不能檢測染色體微小變異，也就是說，F(xiàn)ISH檢測結(jié)果為陰性的樣本，并不能說明該樣本不存在由易位、倒位、缺失及重復(fù)等結(jié)構(gòu)異常所導(dǎo)致的染色體核型異常。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有15%～30%的核型異常是FISH不能檢測出來的[8]。FISH存在有一定的假陽性率和假陰性率。有文獻(xiàn)進(jìn)行了大樣本的研究，分析了29039例樣本只有1例假陽性(假陽性率=0.003%)和7例假陰性結(jié)果(假陰性率=0.024%)[9]。

3.3 CNV-seq 應(yīng)用本研究224例檢測成功率100%，陽性樣本占總樣本率51%(114/224)，低于范寶光等[10]研究的64.15%，徐蕾等[11]研究的79.59%。單純數(shù)目異常為31.70%(71/224)，嵌合體為3.12%(7/224)，其他染色體畸變包含微缺失/微重復(fù)為16.07%(36/2224)。文獻(xiàn)報(bào)道[12]流產(chǎn)染色體異常16-三體最多見，其次21-三體和22號(hào)三體。Jiandong Shen等[13]采用高通量測序技術(shù)檢測了 436 例流產(chǎn)絨毛樣本，檢出異常核型樣本 225 例，占 51.6%，包括188 例非整倍體異常，23 例片段微缺失微重復(fù)，及 14 例三倍體。1978年顧世光報(bào)道，早期稽留流產(chǎn)中 30.5%～54.9%的流產(chǎn)兒具有異常染色體[14]。趙佳[15]等人對 1032 例大樣本流產(chǎn)絨毛樣本進(jìn)行檢測，檢出異常核型445 例，異常率 43.12%。我們研究224例稽留流產(chǎn)患者中特納綜合征20例，16-三體19例，22-三體7例，21-三體6例，也是比較常見，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符合。其次13-三體3例，14-三體2例，20-三體1例，18-三體1例，15-三體1例，8-三體1例，4-三體1例，三倍體8例。特納綜合征病例大多數(shù)在胚胎期流產(chǎn)。本研究檢測20%以上的染色體嵌合及染色體微缺失/微重復(fù)變異。其他染色體畸變包含微缺失/微重復(fù)為16.07%(36/224)。

3.4 CNV-seq的優(yōu)勢與細(xì)胞培養(yǎng)核型分析相比其特異性、敏感性在檢測染色體數(shù)目異常上具有較高的一致性，能夠精確分析，利用Hiseq2500測序快速要得到結(jié)果，在時(shí)間上有較大優(yōu)勢。由于不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，減少了細(xì)胞培養(yǎng)失敗的可能性。相較于染色體核型分析和FISH技術(shù)，采用高通量基因測序技術(shù)對流產(chǎn)絨毛進(jìn)行檢測有以下幾方面的優(yōu)勢。第一，高通量測序又可稱為新一代深度測序，是指一次性能并行測序幾百萬到十億條DNA分子，可對一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行更深入、更全面、更細(xì)致的分析[16]。以Solexa技術(shù)為例，采用了該技術(shù)的Hi Seq 2500 測序儀，一臺(tái)機(jī)器在短短兩周的時(shí)間內(nèi)能產(chǎn)出超過300G 的數(shù)據(jù)，這相當(dāng)于把人類基因組重復(fù)測序100遍以上，短時(shí)間內(nèi)大輸出量的測序與以往技術(shù)相比較最突出的優(yōu)勢。第二，實(shí)驗(yàn)對樣本要求較低，即使絨毛樣本退化只要DNA含量達(dá)到一定的測序要求就能對樣本進(jìn)行檢測，這就很大程度上提升了樣本的檢測成功率。第三，對于染色體結(jié)構(gòu)異常，該技術(shù)可檢測到100kb以上的染色體片段的微缺失和微重復(fù)，提高了染色體異常的檢出率。而以往使用染色體核型分析技術(shù)只能排查出10Mb以上的染色體結(jié)構(gòu)異常，這就導(dǎo)致很多存在細(xì)微結(jié)構(gòu)異常的染色體被漏診，所以有學(xué)者認(rèn)為，早期自然流產(chǎn)絨毛的染色體異常率實(shí)際上應(yīng)該高于普遍報(bào)道的50%[17]。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過大樣本量的研究，采用高通量檢測技術(shù)對智力低下的患者進(jìn)行遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些患者存在染色體結(jié)構(gòu)上的微缺失微重復(fù)[18]。

3.5 CNV-seq結(jié)果解讀分析絨毛組織染色體畸變是否存在，如結(jié)果無異常時(shí)，可以基本排除稽留流產(chǎn)非遺傳物質(zhì)染色體畸變所致，建議夫妻進(jìn)行其他檢查。流產(chǎn)原因還有精子畸形率、免疫、感染環(huán)境等等。如染色體畸變?yōu)榉钦扼w多數(shù)是生殖細(xì)胞成熟或受精卵早期卵裂過程中，染色體不分離或丟失等原因造成的[19]?；袅鳟a(chǎn)的病因可能與夫妻年齡、情緒、孕前孕期接觸有毒有害物理、化學(xué)、藥物等不良環(huán)境相關(guān)。如染色體畸變?yōu)槿笔?重復(fù)，考慮拷貝數(shù)變異是新發(fā)突變還是來源于親本(夫妻之一)，夫妻均需行CNV-seq檢測。無論是新發(fā)突變還是來源親本再次妊娠均需進(jìn)行遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷。

總之，應(yīng)用CNV-seq對稽留流產(chǎn)絨毛組織染色體畸變進(jìn)行檢測能明確稽留流產(chǎn)的病因，有利于臨床醫(yī)師快速準(zhǔn)確尋找稽留流產(chǎn)病因，對再次妊娠有重要的指導(dǎo)意義。