朱曉瑩 孟霄 甘宏濤

摘要：在溫度為15 ℃、pH值為8條件下，測定由初始鹽度2.5%變化至不同鹽度（1.5%、2.0%、3.0%、3.5%）對單環(huán)刺螠非特異性免疫指標(biāo)（血細(xì)胞密度、SOD和ACP活力、MDA含量）的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽度變化后，血細(xì)胞密度在48 h內(nèi)和鹽度呈顯著正相關(guān);各試驗(yàn)組SOD活力呈先升后降的趨勢，而MDA含量表現(xiàn)為先降后升，且MDA含量與SOD活力呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.969，P<0.05）;ACP活力則呈現(xiàn)2種變化趨勢，鹽度1.5%和2.0%2組先降后升再降，鹽度3.0%和3.5%2組先升后降。至處理96 h，鹽度1.5%和3.5%2組的血細(xì)胞密度、SOD和ACP活力顯著低于對照組，而MDA含量顯著高于其他各組（P<0.05）。鹽度2.0%～3.0%為單環(huán)刺螠較適宜的環(huán)境條件，鹽度1.5%和3.5%條件下其免疫力顯著下降，以低鹽環(huán)境影響更為明顯。

關(guān)鍵詞：鹽度變化;單環(huán)刺螠;非特異性免疫;血細(xì)胞

中圖分類號： S917? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0197-03

單環(huán)刺螠（Urechis uniconcyus）主要分布于俄羅斯、日本、朝鮮以及我國黃渤海沿岸，是我國沿海存在的唯一無管螠目物種[1]。單環(huán)刺螠肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，其必需氨基酸組成符合人體的吸收比例要求，并富含二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DPA）及Fe、Zn等微量元素，提取物中還有一定的抗腫瘤和提高免疫力作用，因此具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及良好的開發(fā)利用前景[2]。目前，對單環(huán)刺螠的研究主要集中于纖溶酶的分離純化和溶栓作用提取物的分析、硫化物的應(yīng)激代謝以及人工繁育等方面[3-5]，而有關(guān)環(huán)境因子對單環(huán)刺螠免疫功能影響的報(bào)道相對較少。本研究觀察了不同鹽度條件下單環(huán)刺螠免疫相關(guān)指標(biāo)的變化，旨在探討單環(huán)刺螠對鹽度的生理調(diào)節(jié)機(jī)制，為人工養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

單環(huán)刺螠體長（15.1±1.5） cm、體質(zhì)量（31.2±4.2） g，于2017年4月購自江蘇省連云港市水產(chǎn)品市場，采用循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)條件為：鹽度2.5%，pH值=8，水溫 15 ℃，自然光照，連續(xù)充氣，日投喂2次藻液。選擇大小相近、體表無損傷且活力強(qiáng)者用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)初始鹽度為2.5%，設(shè)對照組為2.5%，試驗(yàn)組分別為1.5%、2.0%、3.0%、3.5%。并采用曝氣自來水和海水晶配制所需鹽度的人工海水，pH值為8。每組設(shè)3個平行，每個平行隨機(jī)放20條單環(huán)刺螠，于40 cm×30 cm×30 cm水族缸中飼養(yǎng)，水溫、餌料、充氣等養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時相同。每天定時換水1次，每次換水50%。每個平行分別于6、12、24、48、72、96 h取3條單環(huán)刺螠，用蒸餾水沖洗，濾紙吸干體表水分，進(jìn)行解剖并取其血液，保留部分全血用于測定血細(xì)胞密度，另一部分于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液血清，于-80 ℃保存，進(jìn)行測定其他免疫相關(guān)指標(biāo)。

1.3 檢測方法

用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算血細(xì)胞密度，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力采用連苯三酚自氧化法測定[6]，酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）活力、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和樣品蛋白含量參考南京建成生物工程研究所試劑盒說明進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因子方差分析，LSD多重比較和Duncans檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度變化對單環(huán)刺螠血細(xì)胞密度的影響

由圖1可知，處理6 h時，各組血細(xì)胞密度和鹽度呈顯著正相關(guān)（r2=0.955，P<0.05），以鹽度1.5%組血細(xì)胞密度（1.20×108個/mL）最低，僅為鹽度3.5%組的67%。處理12 h時，各試驗(yàn)組血細(xì)胞密度均有所上升，以鹽度3.0%、3.5%組升高幅度較大，并顯著高于鹽度2.5%組，而鹽度1.5%組血細(xì)胞密度雖有所回升，但仍顯著低于其他各組（P<0.05）。隨處理時間的延長，鹽度1.5%、3.0%、3.5%組血細(xì)胞密度呈現(xiàn)下降趨勢，至處理48 h時，各組血細(xì)胞密度和鹽度仍呈顯著正相關(guān)（r=0.987，P<0.05）。處理96 h后，以鹽度1.5%組血細(xì)胞密度最低，鹽度3.5%組次之，而鹽度2.0%、2.5%、3.0%組的血細(xì)胞密度組間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 鹽度變化對單環(huán)刺螠SOD活力的影響

由圖2可知，鹽度變化對單環(huán)刺螠SOD活力的影響顯著。除鹽度2.5%組SOD活力略有波動外，其他組均呈先升后降趨勢。處理6 h，鹽度3.5%組SOD活力顯著高于其他組，處理 48 h 后升至最高值，隨后下降。鹽度1.5%和2.0% 2組SOD活力上升幅度較小，于處理24 h升至最高。鹽度3.0%組SOD活力在處理6 h時無明顯變化，隨著處理時間延長亦逐漸升高，至處理48 h升至最高，且上升幅度最大。處理96 h后，鹽度1.5%和3.5% 2組SOD活力顯著低于其他試驗(yàn)組（P<0.05），較鹽度2.5%組分別下降54.53%和45.65%。

2.3 鹽度變化對單環(huán)刺螠MDA含量的影響

由圖3可知，鹽度變化后各試驗(yàn)組MDA含量均呈先降后升的趨勢，以鹽度3.5%組MDA含量下降最為明顯。鹽度1.5%和3.5% 2組、鹽度2.0%和3.0%2組分別于處理24、48 h時降至最低，隨后逐漸上升。至處理96 h，以鹽度1.5%組MDA含量最高，鹽度3.5%組次之，其他3個試驗(yàn)組間相近（P>0.05），且MDA含量與SOD活力呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.969，P<0.05）。

2.4 鹽度變化對單環(huán)刺螠ACP活力的影響

由圖4可知，鹽度變化后，單環(huán)刺螠ACP活力呈現(xiàn)2種變化趨勢，由初始鹽度2.5%下降至1.5%和2.0%，ACP活力呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢;而由鹽度2.5%升高至3.0%和3.5%，ACP活力則呈現(xiàn)先升后降趨勢。鹽度1.5%和2.0%2組在處理6 h后，ACP活力顯著低于對照組，隨后回升，至處理24 h后升至最高值后下降。鹽度3.0%組和3.5%組ACP活力分別處理72、48 h后升至最高，以鹽度3.0%組上升幅度最大。處理96 h后，以鹽度3.0%組ACP活力最高，鹽度1.5%和3.5%2組顯著低于對照組（P<0.05）。

3 討論

3.1 鹽度變化對單環(huán)刺螠血細(xì)胞密度的影響

無脊椎動物血細(xì)胞是其免疫功能的主要實(shí)施者，血細(xì)胞在發(fā)揮吞噬功能時還會釋放一些免疫因子，與血淋巴中的其他免疫因子互相協(xié)同以抵御外來病原對機(jī)體的侵害[7]。據(jù)報(bào)道，鹽度變化對血細(xì)胞有顯著影響，降低和升高都會導(dǎo)致血細(xì)胞減少，而低鹽度條件下血細(xì)胞減少更為顯著[8-9]。但

Reid等研究發(fā)現(xiàn)，鹽度在2.0%～4.0%范圍內(nèi)，菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）血細(xì)胞密度在鹽度為2.0%時減少，在鹽度為4.0%時顯著增多[10]。本結(jié)果表明，鹽度變化對單環(huán)刺螠血細(xì)胞密度有顯著影響，短期內(nèi)高鹽度3.5%組單環(huán)刺螠血細(xì)胞密度顯著增多，這與Reid等的高鹽度脅迫下血細(xì)胞密度顯著增多的研究結(jié)果[10]一致。隨著處理時間的延長，鹽度2.0%、2.5%和3.0%組的血細(xì)胞密度無顯著差異，但鹽度1.5%和3.5%2組血細(xì)胞密度顯著低于其他試驗(yàn)組，與Zhao等對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的研究結(jié)果[11]相近。在處理6～48 h，單環(huán)刺螠的血細(xì)胞密度和鹽度呈顯著正相關(guān)，這可能由于鹽度變化后，機(jī)體處于低滲或高滲環(huán)境中，為調(diào)整體內(nèi)外滲透壓的平衡而導(dǎo)致血細(xì)胞密度變化。長時間脅迫下，鹽度15和35兩組血細(xì)胞密度顯著降低，表明單環(huán)刺螠處于不適宜鹽度環(huán)境下其免疫力受到較大的影響。

3.2 鹽度變化對單環(huán)刺螠SOD活力和MDA含量的影響

生物體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生活性氧自由基，對機(jī)體可造成氧化損傷，而SOD可以清除過量的自由基，對保護(hù)機(jī)體免受自由基損害起著重要作用[12]。Wang等將鹽度由2.5%變化至0.5%、1.5%和3.5%后96 h，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）血液SOD活力分別下降52%、27%和24%[13]。鄭慧等研究發(fā)現(xiàn)，鹽度變化會引起刺參（Apostichopus japonicus）體腔液SOD活力降低[14]。本研究結(jié)果表明，鹽度的升高或降低都會使單環(huán)刺螠SOD活力呈先升后降的趨勢，表明機(jī)體在遭遇鹽度突變時，會引發(fā)一系列生理應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過量的氧自由基，誘發(fā)SOD活性增強(qiáng)，以降低鹽度突變對機(jī)體的氧化損傷，增強(qiáng)免疫能力和對鹽度突變的耐受能力，與高杉等對大竹蟶（Solen grandis）的研究結(jié)果[15]一致。鹽度變化96 h后，鹽度變化幅度較大的15和35兩組SOD活力顯著下降，表明機(jī)體的滲透調(diào)節(jié)負(fù)擔(dān)過重會導(dǎo)致其抗氧化系統(tǒng)受損，尤以低鹽的影響更為顯著。

MDA是生物膜中多不飽和脂肪酸在活性氧自由基攻擊下而引發(fā)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量能夠直接反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度和速率，可廣泛用于氧化應(yīng)激中自由基產(chǎn)生和生物膜氧化損傷程度的評價(jià)指標(biāo)[16]。季延濱等將革胡子鲇（Claries lazera）的水體鹽度升高96 h后，其血清MDA含量顯著升高[17]。鹽度變化后單環(huán)刺螠MDA含量均呈先降后升的趨勢，以鹽度1.5%和3.5%2組變化幅度較大，表明低鹽度短時間的鹽脅迫能引起機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，適當(dāng)提高其免疫力，而長時間高鹽度變化會造成較大的氧化損傷。本研究中MDA含量與SOD活力呈顯著負(fù)相關(guān)，故可將SOD活力和MDA含量的長期變化用于評價(jià)鹽度變化下單環(huán)刺螠的免疫狀態(tài)。

3.3 鹽度變化對單環(huán)刺螠ACP活力的影響

ACP是在酸性條件下，催化磷酸單酯水解的酶為溶酶體的標(biāo)志酶，在溶酶體發(fā)揮正常生理功能及機(jī)體免疫中起重要作用[18]。印度明對蝦（Fenneropenaeus indicus）在鹽度變化后其ACP活力均呈先升后降的趨勢，于72 h升至最高[19]。在鹽度2.5%、3.5%、4.0%下，刺參體腔液ACP活力于10 d達(dá)到最高值后下降[14]。本研究中，由鹽度2.5%升高至3.0%、3.5%，單環(huán)刺螠ACP活力先升后降，與上述研究結(jié)果相近。鹽度3.0%組ACP活力升高幅度最大，且處理96 h后仍然顯著高于鹽度2.5%組，表明適當(dāng)?shù)柠}度變化可刺激機(jī)體的免疫力有所提高。而由初始鹽度2.5%下降至1.5%和2.0%，單環(huán)刺螠ACP活力表現(xiàn)為先下降，表明機(jī)體處在低鹽環(huán)境下，進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)需要消耗更多能量從而影響其免疫力。鹽度變化96 h后，鹽度2.0%組ACP活力與鹽度2.5%組相近，表明適當(dāng)?shù)柠}度下降后，機(jī)體通過一段時間調(diào)整可達(dá)到新的滲透平衡;而鹽度1.5%和3.5%2組ACP活力顯著低于對照組，表明過低和過高的鹽度都會對機(jī)體免疫力產(chǎn)生不利影響。

綜上所述，鹽度變化對單環(huán)刺螠非特異性免疫有較大影響，鹽度2.0%～3.0%為單環(huán)刺螠較適宜的環(huán)境條件，鹽度1.5%和3.5%條件下其免疫力顯著下降，以低鹽環(huán)境下影響更為明顯。在適當(dāng)范圍內(nèi)，機(jī)體可通過自身的調(diào)節(jié)來適應(yīng)環(huán)境中的鹽度變化，但鹽度的變化幅度較大會使機(jī)體的生理機(jī)能遭受脅迫，免疫力下降，可能引起疾病暴發(fā)。因此，在單環(huán)刺螠的養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖水環(huán)境的鹽度變化不容忽視，尤其是連續(xù)降雨造成養(yǎng)殖水體的鹽度急劇下降時要注意及時換水。

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