吳楚森，王 斌，梁 明，冼燕萍，吳玉鑾，王 莉，陳杰鋒，郭新東,劉冬虹

( 廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東 廣州 511447)

我國化妝品行業(yè)迅速發(fā)展，近兩年來一直保持18%～20%增長，化妝品已經(jīng)成為人們生活的必需品，我國現(xiàn)也成為僅次于美國的全球第二大化妝品市場[1]。其中，美白類化妝品的產(chǎn)量得到快速增長，2019年將占據(jù)半壁江山[2]。研究表明，酪氨酸酶是人體內(nèi)參與黑色素合成的關(guān)鍵酶，因此可通過抑制酪氨酸酶的活性來阻斷黑色素生成，從而達(dá)到美白效果。帶有酚羥基的化合物(如間苯三酚、4-硝基愈創(chuàng)木酚、酚酞、地樂酚)因具有與酪氨酸相似的結(jié)構(gòu)特征，多用作酪氨酸酶的抑制劑[3]，從而起到一定的美白效果。但間苯三酚具有致敏性，可引起嘔吐等急性中毒。酚酞會引起口腔炎癥。4-硝基愈創(chuàng)木酚和地樂酚對皮膚均有一定的刺激性，且地樂酚有劇毒。因此，我國現(xiàn)行的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)對化妝品中禁、限用組分進(jìn)行了明確規(guī)定，其中間苯三酚、4-硝基愈創(chuàng)木酚、酚酞和地樂酚列為禁用組分[4]，歐盟REACH法規(guī)還將酚酞和地樂酚列入高關(guān)注物質(zhì)清單[5]。

巨大的市場發(fā)展?jié)摿瘖y品產(chǎn)品質(zhì)量控制和產(chǎn)品安全性能提出了更高的要求。現(xiàn)階段化妝品、環(huán)境水樣及保健品中酚類物質(zhì)的檢測方法已有報道，如液相色譜法[6-7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]、離子色譜法[11-12]等。但化妝品中間苯三酚、4-硝基愈創(chuàng)木酚、酚酞和地樂酚的同時檢測方法未見報道。

由于化妝品形態(tài)多樣(包括固體、液體、乳狀等)，各類樣品基體不同，成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾多，需根據(jù)檢測目標(biāo)選擇合適的樣品前處理技術(shù)[13]。本文采用溶劑萃取的方式，氮氣吹干后用溶劑復(fù)溶，再采用高效液相色譜(HPLC)測定，優(yōu)化了提取溶劑與復(fù)溶溶劑的種類，建立了水基類、乳液類、膏霜類、粉類及蠟基類化妝品中間苯三酚、4-硝基愈創(chuàng)木酚、酚酞和地樂酚的液相色譜檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀：配二極管陣列檢測器(1260，美國安捷倫科技公司)；分析天平：感量0.01 g(M22002/02，瑞士梅特勒托利多公司)和0.1 mg(XP105，瑞士梅特勒托利多公司)；渦旋振蕩器(MS3型，德國艾卡公司)：最高轉(zhuǎn)速不低于3 000 r/min；離心機(jī)(KDC-40，科大中儀公司)：最高轉(zhuǎn)速不低于4 000 r/min；超聲波清洗儀(KQ-500E，昆山市超聲儀器公司)；氮吹濃縮儀(N-EVAP 112，美國Organomation公司)；超純水儀(PURELAB Pulse，英國ELGA公司)。

間苯三酚、地樂酚、4-硝基愈創(chuàng)木酚和酚酞標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于96%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯化鈉、四氫呋喃、磷酸、乙酸銨(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)，超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

用1 mL丙酮溶解適量的間苯三酚、地樂酚、4-硝基愈創(chuàng)木酚和酚酞標(biāo)準(zhǔn)品，再用乙腈配成質(zhì)量濃度為5 000.0 mg/L的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別吸取4種化合物單標(biāo)貯備液各2 mL，用乙腈定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度為1 000.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于4 ℃避光保存。臨用前，用乙腈將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級稀釋至所需濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品處理

1.3.1 水基類、乳液類、膏霜類、粉類稱取試樣0.2 g(精確至0.01 g)于15 mL具塞塑料離心管中，加入2.0 mL提取溶劑(水基類：乙酸乙酯；膏霜類：甲醇；乳液類、粉類：甲醇+丙酮(1∶1，體積比))，3 000 r/min渦旋振蕩2 min。粉類化妝品提取液11 000 r/min離心3 min，取上清液過0.45 μm濾膜，待測定。水基類、膏霜類和乳液類化妝品則取提取液上清層，40 ℃氮吹至干。依次加入100 μL乙腈和900 μL水，分別渦旋復(fù)溶取出，合并溶液，11 000 r/min離心3 min，取上清液過0.45 μm濾膜，待測定。

1.3.2 蠟基類稱取試樣0.1 g(精確至0.01 g)于15 mL具塞塑料離心管中，加入1 mL四氫呋喃，渦旋溶解后加入2 mL甲醇，3 000 r/min渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心3 min，取上清液，40 ℃氮吹至干，依次加入100 μL四氫呋喃和900 μL甲醇+丙酮(1∶1)溶劑，分別渦旋復(fù)溶取出，合并溶液，11 000 r/min離心3 min，取上清液過0.45 μm濾膜，待測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm(i.d.)；流速：0.8 mL/min；流動相A：乙腈，B：10 mmol/L乙酸銨(含0.2%磷酸)；流動相梯度：0～1 min，10%A；1～5 min，10%～25%A；5～7 min，25%～40%A；7～9 min，40%～70%A；9～12 min，70%A；12～15.01 min，70%～95%A；15.01～17 min，95%A；17～17.01 min，95%～10%A；17.01～20 min，10%A；柱溫：40 ℃；檢測波長：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相選擇

比較了分別以乙腈+水和乙腈+10 mmol/L乙酸銨為流動相時4種酚類的分離效果。結(jié)果表明，4種酚類在乙腈+10 mmol/L乙酸銨的流動相體系中可獲得更好的分離度，但地樂酚的峰形較差，這是由于酚羥基易解離出氫離子，離子態(tài)的地樂酚易導(dǎo)致其色譜峰展寬。通過加入0.2%磷酸，調(diào)節(jié)溶液pH值至3.0，地樂酚在此緩沖鹽體系下呈分子態(tài)，經(jīng)C18柱分離后峰形尖銳、對稱。綜合考慮，選擇乙腈+10 mmol/L乙酸銨(含0.2%磷酸)為流動相體系。

圖1 4種酚類物質(zhì)的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of 4 phenols1.phloroglucinol,2.4-nitroguaiacol,3.phenolphthalein,4.dinoseb

圖2 不同提取溶劑對4種酚類的提取回收率Fig.2 Extraction recoveries of 4 phenols by different solvents1.phloroglucinol，2.dinoseb,3.4-nitroguaiacol，4.phenolphthalein

2.2 梯度洗脫程序的優(yōu)化

液相色譜通常采用梯度洗脫以使復(fù)雜樣品中的各組分能按各自適宜的容量因子(k)達(dá)到良好的分離效果。本實驗考察了乙腈+10 mmol/L乙酸銨(含0.2%磷酸)為流動相的梯度洗脫程序。按“1.4”的優(yōu)化梯度洗脫程序可使4種酚類物質(zhì)達(dá)到基線分離，其液相色譜圖見圖1。

2.3 檢測波長的選擇

考察了4種酚類物質(zhì)的紫外吸收光譜圖。結(jié)果顯示，間苯三酚的最大紫外吸收波長為225 nm，4-硝基愈創(chuàng)木酚在240 nm和340 nm有最大紫外吸收，酚酞在230 nm和280 nm處有最大紫外吸收，地樂酚的最大紫外吸收波長為270 nm。為了兼顧4種酚類的紫外吸收，且獲得比例合理的各峰強(qiáng)度，最終選擇檢測波長為230 nm。

2.4 提取溶劑種類的優(yōu)化

2.4.1 水基類、乳液類及膏霜類化妝品針對水基類、乳液類及膏霜類化妝品，選取甲醇、乙腈、乙酸乙酯、水+丙酮(1∶1，體積比)、丙酮+甲醇(1∶1，體積比)和丙酮作為提取溶劑，考察了不同提取溶劑對4種化合物提取回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。數(shù)據(jù)表明，乙酸乙酯對水基類化妝品中4種酚類的提取效果優(yōu)于甲醇和乙腈，且乙酸乙酯與水不互溶，簡單離心后即可實現(xiàn)分離。對于乳液類化妝品，由于其不溶于乙酸乙酯，渦旋提取時聚成團(tuán)狀，溶劑無法滲透樣品，導(dǎo)致4種酚類物質(zhì)的回收率均較低；但采用甲醇、水+丙酮(1∶1)時，間苯三酚和地樂酚的回收率也較低，無法滿足檢測需求；而采用丙酮+甲醇(1∶1)混合溶劑時，乳液類化妝品可在溶劑中分散，4種酚類的回收率較高。膏霜類化妝品中，乙酸乙酯對4種酚類物質(zhì)的提取效果差、回收率低；甲醇和丙酮對4種酚類的回收率相近；采用丙酮提取時，共萃雜質(zhì)多、色譜基線高、干擾峰多。綜合考慮，分別采用乙酸乙酯、丙酮+甲醇(1∶1)、甲醇作為水基類、乳液類和膏霜類化妝品的提取溶劑。

2.4.2 粉類化妝品由于粉類化妝品呈細(xì)微粉末狀，本實驗選擇丙酮+甲醇(1∶1)溶劑進(jìn)行提取，此時丙酮分子能有效浸潤粉末，減小溶劑進(jìn)入樣品基體的阻滯，增加甲醇進(jìn)入樣品基體的擴(kuò)散，從而使得甲醇能有效地提取4種酚類物質(zhì)。

2.4.3 蠟基類化妝品蠟基類化妝品因常加入蜂蠟等蠟質(zhì)，呈粘性塊狀。由于其樣品基質(zhì)復(fù)雜，直接采用常規(guī)溶劑提取效果不佳。采用四氫呋喃可有效溶解蠟質(zhì)樣品，使其分散。由于蠟不溶于甲醇等極性溶劑，加入四氫呋喃分散后再加入甲醇，在提取目標(biāo)物的同時可使蠟質(zhì)形成沉淀除去。

2.5 樣品待測液復(fù)溶條件的優(yōu)化

樣品經(jīng)溶劑萃取后，為提高檢測靈敏度，將待測液40 ℃氮吹至干后選用合適的溶劑進(jìn)行復(fù)溶，定容至1 mL待測。針對水基類、乳液類和膏霜類化妝品，考察了乙腈、甲醇、乙腈+水(1∶9)3種溶劑的復(fù)溶效果。結(jié)果顯示，采用單純有機(jī)相進(jìn)行復(fù)溶時，間苯三酚的色譜出峰時間前移，色譜響應(yīng)低。選擇乙腈+水(1∶9)混合溶劑進(jìn)行復(fù)溶時，間苯三酚的色譜出峰時間無漂移，且色譜峰響應(yīng)高，但地樂酚的色譜峰響應(yīng)降低至純?nèi)軇┨崛r的20%以下。3種提取溶劑對4-硝基愈創(chuàng)木酚和酚酞的色譜峰形和響應(yīng)均無顯著影響。由于單獨使用純有機(jī)溶劑和水對間苯三酚和地樂酚有顯著影響，擬先加入100 μL乙腈對樣品進(jìn)行復(fù)溶后取出，再加入900 μL水復(fù)溶取出，合并兩次溶液。實驗結(jié)果顯示，采用該方法可以兼顧間苯三酚和地樂酚，獲得良好的色譜峰形和響應(yīng)。

蠟基類化妝品待測液在氮吹至干后，仍有少量蠟質(zhì)殘留，加入乙腈+水(1∶9)溶液復(fù)溶后，溶液渾濁，離心后測定，4種酚類物質(zhì)的色譜峰響應(yīng)降低。擬加入少量四氫呋喃復(fù)溶，再加入乙腈+水(1∶9)復(fù)溶合并，復(fù)溶液渾濁，各化合物的回收率低。選用丙酮+甲醇(1∶1)進(jìn)行復(fù)溶合并時，復(fù)溶液澄清，各化合物的回收率高。因此，最終復(fù)溶方式為先加入100 μL四氫呋喃對樣品進(jìn)行復(fù)溶后取出，再加入900 μL丙酮+甲醇(1∶1)復(fù)溶取出，合并兩次復(fù)溶液。

粉類化妝品采用1 mL丙酮+甲醇(1∶1)直接提取，無須進(jìn)行氮吹和復(fù)溶操作，實驗步驟簡單快捷。

2.6 線性范圍、檢出限與定量下限

采用優(yōu)化方法對4種酚類物質(zhì)進(jìn)行線性與靈敏度考察，并分別按信噪比(S/N)為3和10計算檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。以目標(biāo)化合物濃度(x，mg/kg)為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值的峰面積(y)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，4種待測物在5～500 mg/kg范圍內(nèi)線性良好，r2>0.99，LOD為1.5～6.0 mg/kg，LOQ為5.0～20.0 mg/kg(見表1)。

表1 4種酚類物質(zhì)的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限及定量下限Table 1 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients(r2),LOD and LOQ of four phenols

2.7 回收率與精密度

選取陰性水基類、乳液類、膏霜類、粉類及蠟基類化妝品樣品，按本方法進(jìn)行3個水平(1LOQ、2LOQ、10LOQ)的加標(biāo)回收實驗。每個水平平行測定6次，回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表2。由實驗可知，在加標(biāo)水平范圍內(nèi)，間苯三酚的平均回收率為81.3%～99.7%，RSD為1.3%～8.2%；4-硝基愈創(chuàng)木酚的平均回收率為81.9%～94.2%,RSD為1.0%～6.4%；酚酞的平均回收率為82.9%～100%，RSD為1.8%～6.9%；地樂酚的平均回收率為81.9%～99.0%，RSD為1.5%～7.1%。

2.8 實際樣品的檢測

隨機(jī)抽取市售的31個化妝品，其中水基類化妝品6個，乳液類化妝品8個、膏霜類化妝品10個、粉類化妝品4個、蠟基類化妝品3個，按本方法進(jìn)行檢測，31個化妝品均未檢出間苯三酚、4-硝基愈創(chuàng)木酚、酚酞及地樂酚。

表2 4種酚類物質(zhì)的加標(biāo)濃度、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Spiked levels,recoveries and RSDs of four phenols

3 結(jié) 論

本研究建立了化妝品中禁用的間苯三酚、4-硝基愈創(chuàng)木酚、酚酞和地樂酚的檢測方法。樣品經(jīng)溶劑提取、氮氣吹干、復(fù)溶后采用高效液相色譜法測定，外標(biāo)法定量。本方法前處理簡單、靈敏度高，適用于水基類、乳液類、膏霜類、粉類及蠟基類化妝品中地樂酚等4種禁用物質(zhì)的檢測。