楊赟 王蘊(yùn)紅 王智強(qiáng)

1 首都體育學(xué)院研究生部（北京100191）

2 首都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)與健康學(xué)院

Sestrin2 是應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白Sestrins 家族中的重要成員，在機(jī)體受到應(yīng)激刺激，如DNA 損傷、氧化應(yīng)激、缺氧等情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生[1]。AMPK（Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase，磷酸腺苷活化蛋白激酶）作為一種重要的蛋白激酶參與多種代謝過(guò)程，其活性主要受AMP/ATP 比值調(diào)控。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)如運(yùn)動(dòng)、組織缺血、缺氧等，都可以使AMP/ATP 比值升高，啟動(dòng)AMPK激酶系統(tǒng)，刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪酸氧化等增加ATP 產(chǎn)生的代謝過(guò)程，同時(shí)阻斷脂類、蛋白質(zhì)合成以及糖異生等需消耗ATP 的代謝通路[2]。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞Sestrin2 的表達(dá)可顯著提高能量狀態(tài)感受因子AMPK Thr172位點(diǎn)磷酸化水平[3]，且4周和6周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能引起小鼠骨骼肌Sestrin2蛋白表達(dá)和AMPKα 2 磷酸化水平顯著增加，提示運(yùn)動(dòng)可通過(guò)Sestrin2 激活A(yù)MPKα2信號(hào)分子[4]。也有研究表明，低氧應(yīng)激能夠顯著提高人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Sestrin2 蛋白表達(dá)[5]。Sestrin2 是一種高度特異的亮氨酸傳感器，機(jī)體內(nèi)的亮氨酸能夠通過(guò)Sestrin2 調(diào)控mTORC1 信號(hào)通路[6，7]。但目前有關(guān)運(yùn)動(dòng)心肌以及低氧/亮氨酸干預(yù)能否通過(guò)調(diào)控運(yùn)動(dòng)心肌Sestrin2/AMPKα2 信號(hào)通路來(lái)調(diào)控心肌能量代謝的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立單純運(yùn)動(dòng)模型、低氧運(yùn)動(dòng)模型和運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型，探討Sestrin2/AMPKα2 信號(hào)通路在運(yùn)動(dòng)心肌中的時(shí)相變化以及低氧或亮氨酸干預(yù)時(shí)運(yùn)動(dòng)心肌Sestrin2/AMPKα2信號(hào)通路的表達(dá)規(guī)律。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

8 周雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2015-0001）。以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為溫度23℃～25℃，相對(duì)濕度在41%～53%。自然晝夜節(jié)律變化，光照和黑暗交替各12 h（光照時(shí)間在8：00-20：00）。

1.2 建立單純運(yùn)動(dòng)模型

1.2.1 動(dòng)物分組

本實(shí)驗(yàn)分為急性耐力運(yùn)動(dòng)模型和4 周運(yùn)動(dòng)模型，80只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分組。急性耐力運(yùn)動(dòng)模型分為安靜組（Con）、運(yùn)動(dòng)后0小時(shí)取材組（E0）、運(yùn)動(dòng)后3小時(shí)取材組（E3）、運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)取材組（E24）。4周耐力運(yùn)動(dòng)模型分為安靜組（4Con）、運(yùn)動(dòng)后0 小時(shí)取材組（4E0）、運(yùn)動(dòng)后3小時(shí)取材組（4E3）、運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)取材組（4E24）。每組10只。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)方案

急性耐力運(yùn)動(dòng)模型運(yùn)動(dòng)方案參照Bedford[8]漸增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)建立模型，只進(jìn)行一次耐力運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)方案為：初始坡度5°，速度10 m/min，每運(yùn)動(dòng)5 min 速度增加5 m/min。15 min 后速度增加至19 m/min，繼續(xù)運(yùn)動(dòng)45min。4周運(yùn)動(dòng)模型訓(xùn)練方案：適應(yīng)性訓(xùn)練周坡度由5°遞增至10°，速度為14 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間由15 min 遞增至25 min。訓(xùn)練周從第1 周至第4 周坡度保持10°，速度由14 m/min 逐漸遞增到24 m/min。運(yùn)動(dòng)時(shí)間從第1 周到第3 周由30 min 緩慢遞增到60 min，并保持到訓(xùn)練結(jié)束。動(dòng)物每周訓(xùn)練5天，休息2天。

急性耐力運(yùn)動(dòng)模型和4周運(yùn)動(dòng)模型在運(yùn)動(dòng)后按時(shí)間點(diǎn)取材，安靜組同時(shí)取材。大鼠取材前12小時(shí)開(kāi)始禁食，腹腔注射麻醉，打開(kāi)胸腔取心臟，用預(yù)冷生理鹽水清洗，濾紙吸凈血液和生理鹽水，心臟迅速稱重，分離左心室，液氮凍存。所有操作均在冰上完成，樣本于-80℃冰箱保存。

1.3 建立低氧運(yùn)動(dòng)模型

1.3.1 動(dòng)物分組

60 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為：常氧安靜組（Con）、常氧耐力運(yùn)動(dòng)組（En）、常氧力竭運(yùn)動(dòng)組（Ex）、低氧安靜組（Hypo）、低氧耐力運(yùn)動(dòng)組（Hypo+En）和低氧力竭運(yùn)動(dòng)組（Hypo+Ex）。每組10只。

1.3.2 運(yùn)動(dòng)方案

低氧運(yùn)動(dòng)模型中的常氧組在正常氧含量下安靜放置或運(yùn)動(dòng)，低氧組在北京體育大學(xué)動(dòng)物房低氧房模擬4500米海拔氧環(huán)境（氧含量約11.8%）下放置或運(yùn)動(dòng)，低氧安靜組在低氧環(huán)境下安靜放置，低氧運(yùn)動(dòng)組在低氧環(huán)境下運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)方案參照Leandro[9]漸增負(fù)荷耐力運(yùn)動(dòng)方案：坡度10°，初始速度5 m/min，運(yùn)動(dòng)4 min后速度增加5 m/min。之后每運(yùn)動(dòng)3 min速度增加5 m/min。耐力運(yùn)動(dòng)組終速度為40 m/min，總運(yùn)動(dòng)時(shí)間為25 min。力竭運(yùn)動(dòng)組速度遞增到50 m/min后運(yùn)動(dòng)至力竭。

低氧運(yùn)動(dòng)模型所有運(yùn)動(dòng)組在運(yùn)動(dòng)后即刻取心臟，安靜組同時(shí)取材。取材方法同實(shí)驗(yàn)一。

1.4 建立運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型

1.4.1 動(dòng)物分組

本實(shí)驗(yàn)分為補(bǔ)充亮氨酸急性耐力運(yùn)動(dòng)模型和4周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型，80 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分組。急性耐力運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型分為安靜組（Con）、單純運(yùn)動(dòng)組（E）、單純補(bǔ)充亮氨酸組（Leu）和補(bǔ)充亮氨酸運(yùn)動(dòng)組（Leu+E）。4 周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型分為安靜組（4Con）、單純運(yùn)動(dòng)組（4E）、單純補(bǔ)充亮氨酸組（4Leu）和運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸組（4Leu+E）。每組10只。

1.4.2 運(yùn)動(dòng)方案

急性耐力運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型運(yùn)動(dòng)方案同實(shí)驗(yàn)一急性耐力運(yùn)動(dòng)模型運(yùn)動(dòng)方案，4周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型運(yùn)動(dòng)方案同實(shí)驗(yàn)一的4周運(yùn)動(dòng)模型訓(xùn)練方案。

1.4.3 亮氨酸灌胃方案

補(bǔ)充亮氨酸模型的灌胃量參照Campos[10]補(bǔ)充亮氨酸大鼠模型，依據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)》中動(dòng)物與人的每公斤體重劑量折算系數(shù)表以及人類每天亮氨酸需要量計(jì)算出大鼠每天亮氨酸的需求補(bǔ)給量為88 mg/g，據(jù)此計(jì)算出大鼠每日灌胃量灌胃。

急性耐力運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型大鼠在運(yùn)動(dòng)前10 min進(jìn)行灌胃，安靜對(duì)照組和單純運(yùn)動(dòng)組灌胃等體積蒸餾水。補(bǔ)充亮氨酸組灌胃166 mg/kg，濃度83 mg/ml的亮氨酸溶液。4 周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型大鼠在每次運(yùn)動(dòng)后10 min進(jìn)行灌胃，安靜對(duì)照組和單純運(yùn)動(dòng)組灌胃等體積蒸餾水。補(bǔ)充亮氨酸組灌胃166 mg/kg，濃度83 mg/ml 亮氨酸溶液。每周五下午結(jié)束末次運(yùn)動(dòng)后，稱量記錄體重并計(jì)算亮氨酸補(bǔ)劑量。

急性耐力運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型的運(yùn)動(dòng)組在運(yùn)動(dòng)后即刻取材，不運(yùn)動(dòng)組同時(shí)取材。4周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸模型的運(yùn)動(dòng)組在運(yùn)動(dòng)后24 小時(shí)取材，不運(yùn)動(dòng)組同時(shí)取材。取材方法同實(shí)驗(yàn)一。

1.5 Western Blot

稱取一定量心肌組織，按重量：體積比1∶9加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上勻漿，靜置20 min，4℃，13000 rpm 離心20 min。取上清BCA 法蛋白定量。以裂解液調(diào)整蛋白濃度，加入5X 上樣緩沖液，使樣品終濃度為4 μg/μl。95℃，煮沸10 min 后，制成電泳上樣液。配置12%的SDS-PAG分離膠和5%濃縮膠，加樣電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至NC 膜。將膜在一抗中孵育，4℃過(guò)夜，一抗溶于封閉液，Sestrin2（1∶1000，兔抗，abcam 公司）、AMPKα2（1∶1000，兔抗，天德悅公司）、p-AMPKα（Thr172）（1∶2000，兔抗，abcam 公司）、β-actin（1∶20000，鼠抗，天德悅公司）。二抗使用山羊抗兔IgG（H+L），HRP（1∶5000，天德悅公司）和山羊抗鼠IgG（H+L），HRP（1∶10000，天德悅公司），室溫孵育40 min。洗膜后采用ECL發(fā)光試劑與膜在暗室中反應(yīng)曝光、顯影、定影。膠片掃描后，運(yùn)用ImageJ軟件處理后，使用Tota-Lab Quant軟件系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶灰度值，并用目的蛋白的灰度值與相應(yīng)的內(nèi)參蛋白灰度值對(duì)比，得出每個(gè)樣品目的蛋白的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS 進(jìn)行雙因素方差分析（Two-way ANOVA），數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)運(yùn)動(dòng)和各干預(yù)因素（時(shí)間、低氧和亮氨酸）進(jìn)行主效應(yīng)及兩者的交互作用分析。如果主效應(yīng)顯著（P＜0.05）則采用Tukey’s test 進(jìn)行事后多重比較分析（post-hoc test）。P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2 表達(dá)和AMPKα2 激活的影響

2.1.1 急性耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2蛋白表達(dá)的影響

與安靜組相比，運(yùn)動(dòng)后0 h 組心肌Sestrin2 蛋白含量顯著升高（P＜0.05），在運(yùn)動(dòng)后3 h逐漸恢復(fù)到安靜水平。表明急性耐力運(yùn)動(dòng)能夠提高心肌Sestrin2 蛋白表達(dá)（見(jiàn)圖1）。

圖1 急性耐力運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間心肌Sestrin2蛋白表達(dá)

2.1.2 急性耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌AMPKα2激活的影響

與安靜組相比，運(yùn)動(dòng)后0 h組心肌AMPKα2蛋白活性顯著升高（P＜0.05），在運(yùn)動(dòng)后3 h逐漸恢復(fù)到安靜水平。表明急性耐力運(yùn)動(dòng)能夠顯著激活A(yù)MPKα2（見(jiàn)圖2）。

圖2 急性耐力運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間心肌AMPKα2蛋白活性

2.1.3 4周運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)過(guò)4 周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)后各時(shí)間段心肌Sestrin2蛋白含量與安靜組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。說(shuō)明4周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后心肌Sestrin2蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后沒(méi)有顯著性變化（見(jiàn)圖3）。

圖3 4周運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間心肌Sestrin2蛋白表達(dá)

2.1.4 4周運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌AMPKα2激活的影響

經(jīng)過(guò)4周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)后各時(shí)間段心肌AMPKα2蛋白活性與安靜組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。說(shuō)明4周耐力運(yùn)動(dòng)沒(méi)有激活心肌AMPKα2（見(jiàn)圖4）。

圖4 4周運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間心肌AMPKα2蛋白活性

2.2 低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2 表達(dá)和AMPKα2 激活的影響

2.2.1 低氧力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2蛋白表達(dá)的影響

與安靜組相比，常氧力竭運(yùn)動(dòng)組和低氧力竭運(yùn)動(dòng)組在運(yùn)動(dòng)后即刻心肌Sestrin2蛋白含量顯著性增高（P＜0.05）。低氧安靜組和安靜組相比心肌Sestrin2 蛋白含量沒(méi)有顯著性差異。表明力竭運(yùn)動(dòng)和低氧力竭運(yùn)動(dòng)能夠提高心肌Sestrin2蛋白表達(dá)（見(jiàn)圖5）。

圖5 低氧力竭運(yùn)動(dòng)心肌Sestrin2蛋白的表達(dá)

2.2.2 低氧力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌AMPKα2激活的影響

與安靜組相比，常氧力竭運(yùn)動(dòng)組和低氧力竭運(yùn)動(dòng)組在運(yùn)動(dòng)后即刻心肌AMPKα2 蛋白活性顯著性增高（P＜0.05）。低氧安靜組與安靜組相比心肌AMPKα2蛋白活性沒(méi)有顯著性變化。說(shuō)明力竭運(yùn)動(dòng)和低氧力竭運(yùn)動(dòng)能夠顯著激活心肌AMPKα2（見(jiàn)圖6）。

圖6 低氧力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌AMPKα2的影響

2.2.3 低氧耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2蛋白表達(dá)的影響

與安靜組相比，常氧耐力運(yùn)動(dòng)組、低氧安靜組和低氧耐力運(yùn)動(dòng)組心肌Sestrin2 蛋白含量沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05）。說(shuō)明耐力運(yùn)動(dòng)和低氧耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2表達(dá)沒(méi)有影響（見(jiàn)圖7）。

圖7 低氧耐力運(yùn)動(dòng)心肌Sestrin2蛋白的表達(dá)

2.2.4 低氧耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌AMPKα2激活的影響

與安靜組相比，常氧耐力運(yùn)動(dòng)組、低氧安靜組和低氧耐力運(yùn)動(dòng)組心肌AMPKα2蛋白激活水平?jīng)]有顯著性變化（P＞0.05）。表明耐力運(yùn)動(dòng)和低氧耐力運(yùn)動(dòng)沒(méi)有激活心肌AMPKα2（見(jiàn)圖8）。

圖8 低氧耐力運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌AMPKα2激活的影響

2.3 運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸對(duì)心肌Sestrin2 表達(dá)和AMPKα2激活的影響

2.3.1 補(bǔ)充亮氨酸急性運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2蛋白表達(dá)的影響

與安靜組相比，單純運(yùn)動(dòng)組心肌Sestrin2蛋白含量顯著升高（P＜0.05）。補(bǔ)充亮氨酸急性耐力運(yùn)動(dòng)組與安靜組和補(bǔ)充亮氨酸安靜組相比Sestrin2 蛋白含量沒(méi)有出現(xiàn)顯著性變化（P＞0.05）。說(shuō)明補(bǔ)充亮氨酸急性耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2表達(dá)沒(méi)有影響（見(jiàn)圖9）。

圖9 補(bǔ)充亮氨酸急性耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2蛋白表達(dá)的影響

2.3.2 補(bǔ)充亮氨酸急性運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌AMPKα2激活的影響

與安靜組相比，單純運(yùn)動(dòng)組心肌AMPKα2 活性顯著升高（P＜0.05）。單純補(bǔ)亮氨酸組和補(bǔ)亮氨酸運(yùn)動(dòng)組與安靜組相比心肌AMPKα2活性沒(méi)有出現(xiàn)顯著性變化（P＞0.05）。表明補(bǔ)充亮氨酸急性耐力運(yùn)動(dòng)沒(méi)有激活心肌AMPKα2（見(jiàn)圖10）。

圖10 急性耐力運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸對(duì)心肌AMPKα2激活的影響

2.3.3 4周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸對(duì)心肌Sestrin2蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)過(guò)4周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和補(bǔ)亮氨酸，單純運(yùn)動(dòng)組、補(bǔ)亮氨酸安靜組和補(bǔ)亮氨酸運(yùn)動(dòng)組與安靜組相比心肌Sestrin2蛋白含量沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05）。表明4周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸對(duì)心肌Sestrin2蛋白表達(dá)沒(méi)有影響（見(jiàn)圖11）。

圖11 4周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸對(duì)心肌Sestrin2蛋白表達(dá)的影響

2.3.4 4周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸對(duì)心肌AMPKα2激活的影響

經(jīng)過(guò)4周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和補(bǔ)亮氨酸，單純運(yùn)動(dòng)組、補(bǔ)亮氨酸安靜組和補(bǔ)亮氨酸運(yùn)動(dòng)組與安靜組相比心肌AMPKα2 蛋白活性沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05）。表明4周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸沒(méi)有激活心肌AMPKα2（見(jiàn)圖12）。

圖12 4周運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸對(duì)心肌AMPKα2激活影響

3 討論

3.1 耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2 信號(hào)通路激活的影響

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞Sestrin2表達(dá)的升高可顯著提高細(xì)胞能量狀態(tài)感受因子AMPK Thr172 位點(diǎn)磷酸化水平[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)，急性耐力運(yùn)動(dòng)能夠顯著激活心肌AMPKα2[11]。但有關(guān)急性耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2信號(hào)通路的影響研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)后即刻心肌Sestrin2 蛋白表達(dá)顯著升高，說(shuō)明急性耐力運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激能夠提高心肌Sestrin2 蛋白表達(dá)。同時(shí)在急性耐力運(yùn)動(dòng)模型中發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后即刻心肌AMPKα2 活性也顯著升高，提示急性耐力運(yùn)動(dòng)中心肌能通過(guò)Sestrin2 激活A(yù)MPKα2 調(diào)節(jié)心肌能量代謝。而運(yùn)動(dòng)后3 小時(shí)心肌Sestrin2 的表達(dá)和AMPKα2的激活水平恢復(fù)到安靜水平，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2信號(hào)通路的激活是一個(gè)短期的激活。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)四周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，心肌Sestrin2的表達(dá)和AMPKα2的激活水平在運(yùn)動(dòng)后各時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有顯著性差異，提示經(jīng)過(guò)四周耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練心肌Sestrin2/AMPKα2信號(hào)通路表現(xiàn)出對(duì)運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性改變。

3.2 低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2 信號(hào)通路激活的影響

心肌供能以有氧代謝為主，對(duì)低氧刺激比較敏感。急、慢性低氧能使心肌糖原減少，葡萄糖代謝增強(qiáng)，乳酸增加，脂肪酸代謝增強(qiáng)等[12]。有研究表明，低氧暴露能使心肌AMPKα2磷酸化水平顯著增加[13]。還有研究顯示，低氧應(yīng)激能夠顯著提高人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Sestrin2蛋白表達(dá)[5]。但有關(guān)低氧應(yīng)激以及低氧環(huán)境運(yùn)動(dòng)能否引起心肌Sestrin2 表達(dá)和AMPKα2 活性改變還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低氧力竭運(yùn)動(dòng)和常氧力竭運(yùn)動(dòng)均能使心肌Sestrin2 蛋白表達(dá)和AMPKα2活性顯著升高，但兩組之間沒(méi)有顯著性差異，并且單純低氧對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2信號(hào)通路沒(méi)有明顯影響，表明低氧干預(yù)對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2 信號(hào)通路的激活作用不明顯。而低氧耐力運(yùn)動(dòng)組心肌該信號(hào)通路激活也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)變化，進(jìn)一步說(shuō)明低氧環(huán)境下運(yùn)動(dòng)誘發(fā)心肌該信號(hào)通路的變化只與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間有關(guān)，而與缺氧環(huán)境無(wú)明顯的聯(lián)系。盡管發(fā)生的機(jī)制尚不清楚，但有研究顯示，大鼠頸總動(dòng)脈分別結(jié)扎150 min 或100 min，造成兩個(gè)不同程度（嚴(yán)重或中等）的缺氧模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有嚴(yán)重的缺氧模型Sestrin2的表達(dá)顯著升高，而中等程度缺氧模型Sestrin2表達(dá)沒(méi)有變化[14]，表明缺氧不是刺激Sestrin2 表達(dá)所必需的因素。另有研究顯示，一些降低細(xì)胞ATP濃度的物質(zhì)，如2-脫氧葡萄糖（糖酵解抑制劑）和二甲雙胍（線粒體呼吸抑制劑），也能夠誘導(dǎo)Sestrin2表達(dá)[15]，提示Sestrin2表達(dá)與能量供應(yīng)下降有關(guān)。此外，Sestrin2的表達(dá)雖然在一些細(xì)胞是受缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）調(diào)控，而在另一些細(xì)胞類型，缺氧所誘導(dǎo)的Sestrin2 表達(dá)不依賴HIF-1，并且顯示出與其他HIF-1靶基因不同的表達(dá)動(dòng)力學(xué)[5，16]。從上述研究結(jié)果可以得出，Sestrin2的轉(zhuǎn)錄不是由缺氧本身所誘導(dǎo)，而可能是由缺氧引起的能量缺乏所致。因此可以推測(cè)，在本實(shí)驗(yàn)中，單純低氧暴露和低氧非力竭耐力運(yùn)動(dòng)未引起心肌Sestrin2/AMPKα2激活，可能是由于未出現(xiàn)能量供應(yīng)缺乏，而低氧力竭運(yùn)動(dòng)心肌是否出現(xiàn)了能量供應(yīng)缺乏有待進(jìn)一步研究。

3.3 運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充亮氨酸對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2 信號(hào)通路激活的影響

支鏈氨基酸是用于運(yùn)動(dòng)員恢復(fù)的常用補(bǔ)劑[17]，也是心臟攝取的主要氨基酸，雖然氨基酸在心臟ATP 的產(chǎn)生中比重較小，但它們對(duì)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程至關(guān)重要。其中亮氨酸是重要的供能氨基酸，能調(diào)節(jié)糖代謝和蛋白質(zhì)代謝[18]。近來(lái)的研究顯示，Sestrin2是一種高度特異的亮氨酸傳感器[7]。當(dāng)亮氨酸缺乏時(shí)，Sestrin2 與蛋白復(fù)合體GATOR2 交互作用，抑制mTORC1信號(hào)通路激活和細(xì)胞生長(zhǎng)。而亮氨酸存在時(shí)，能夠直接結(jié)合Sestrin2，破壞這種交互作用，使mTORC1 信號(hào)分子激活[6]。但有關(guān)補(bǔ)充亮氨酸對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2 信號(hào)通路作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究通過(guò)給予運(yùn)動(dòng)大鼠口服亮氨酸，觀察補(bǔ)充亮氨酸對(duì)運(yùn)動(dòng)心肌Sestrin2/AMPKα2 信號(hào)通路的急性作用和長(zhǎng)期的效應(yīng)。由于實(shí)驗(yàn)一結(jié)果已經(jīng)顯示，急性耐力運(yùn)動(dòng)后即刻心肌Sestrin2 的表達(dá)和AMPKα2 活性提高，因此我們觀察了運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充亮氨酸的大鼠急性運(yùn)動(dòng)后即刻該信號(hào)通路的變化，結(jié)果顯示，心肌Sestrin2的表達(dá)和AMPKα2活性與安靜組相比沒(méi)有顯著性變化，而未補(bǔ)充亮氨酸的急性耐力運(yùn)動(dòng)組心肌Sestrin2/AMPKα2通路活性顯著性升高。提示補(bǔ)充亮氨酸能夠抑制運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2信號(hào)通路的刺激作用。

以往的研究表明，運(yùn)動(dòng)使AMPKα2 激活后可能通過(guò)磷酸化TSC2 和抑制mTOR 的活性降低p70S6K 的磷酸化，進(jìn)而抑制蛋白合成，促進(jìn)能量底物分解供能[19，20]。AMPKα2 活性的增加還可以抑制mTOR 上游信號(hào)分子Akt 的活性[21]。而Sestrins 能通過(guò)增強(qiáng)AMPKα2 活化，抑制mTORC1活性，從而使細(xì)胞合成代謝的抑制和分解代謝過(guò)程如β-氧化和自噬的增加[1]。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，4 周的遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練能引起Akt/mTOR信號(hào)通路的持續(xù)性激活，為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立4周耐力訓(xùn)練模型，觀察長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)后給與亮氨酸對(duì)Sestrin2/AMPKα2通路的作用，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)4周運(yùn)動(dòng)結(jié)合補(bǔ)充亮氨酸的大鼠心肌Sestrin2 表達(dá)和AMPKα2 活性均與安靜對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。在本實(shí)驗(yàn)中，4周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的大鼠Sestrin2/AMPKα2 通路的活性也與安靜對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，并且我們?cè)谙嗤哪Ｐ蜕线€觀察到mTOR 的活性和心重/體重也沒(méi)有明顯變化。這提示，所采用的4 周運(yùn)動(dòng)方案訓(xùn)練大鼠心肌與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的信號(hào)通路沒(méi)有激活，而補(bǔ)充氨基酸也沒(méi)有對(duì)Sestrin2/AMPKα2/mTOR 信號(hào)通路產(chǎn)生影響。是由于補(bǔ)充亮氨酸只對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激刺激引起的Sestrin2 表達(dá)升高起抑制作用，還是運(yùn)動(dòng)心肌對(duì)一段時(shí)間補(bǔ)充亮氨酸產(chǎn)生了適應(yīng)性改變，還不十分清楚。由于目前還沒(méi)有Sestrin2 的磷酸化抗體，因此有關(guān)補(bǔ)充亮氨酸對(duì)Sestrin2的活性的影響，以及補(bǔ)充亮氨酸對(duì)運(yùn)動(dòng)心肌蛋白質(zhì)合成的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

4.1 急性耐力運(yùn)動(dòng)可以一過(guò)性激活心肌Sestrin2/AMPKα2信號(hào)通路，而對(duì)長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練后心肌Sestrin2/AMPKα2信號(hào)通路表現(xiàn)出對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的適應(yīng)。

4.2 運(yùn)動(dòng)的負(fù)荷量與心肌Sestrin2/AMPKα2 信號(hào)通路的激活關(guān)系密切，而低氧干預(yù)對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2信號(hào)通路的激活作用不明顯。

4.3 補(bǔ)充亮氨酸可抑制急性耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Sestrin2/AMPKα2信號(hào)通路的刺激作用，而經(jīng)過(guò)4周運(yùn)動(dòng)和補(bǔ)充亮氨酸后的心肌Sestrin2/AMPKα2 信號(hào)通路沒(méi)有顯著性變化。