●齊會娟 劉德文 李中賓 張利軍 張春英 高 尊

（大興安嶺地區(qū)農業(yè)林業(yè)科學研究院 黑龍江 大興安嶺 165100）

藍靛果（Lonicera caerulea L.var.edulis Turcz.exHerd.）是忍冬科忍冬屬藍果忍冬的變種。漿果味道酸甜可口，可生食，又可提供色素，亦可釀酒、作飲料和果醬，富含維生素、有機酸、抗壞血酸、糖類，果實中還含有豐富的活性物質，如單寧、花色苷、黃酮、皂苷等，具有降血壓、抗疲勞、保肝、心腦血管保護、抗菌、抗氧化、改善免疫功能、調節(jié)膽固醇等藥理作用[1,2]，有極高的藥用價值。據報道，藍靛果花色苷可降低乙醇對肝臟所造成的損傷[3]，藍靛果花色苷通過提高高脂血癥大鼠肝臟內LXR、CYP7a1 m RNA表達，降低PPARmRNA表達來調節(jié)高脂血癥大鼠的血脂水平，預防動脈硬化的發(fā)生[4]，因此花色苷除了作為食用色素外，它還對人類的腫瘤、衰老、心血管病等疾病的預防與治療有重要的意義[5]；藍靛果忍冬相較于其他植物含有更為豐富的花色苷，因而受到各國學者的高度重視[6]，但是藍靛果果實中有益于健康的活性物質的含量與其生長環(huán)境、地理位置密切相關，不同的生長環(huán)境果實中的花色苷含量不同[7]。本文以大興安嶺地區(qū)同一資源圃中野生藍靛果、栽培藍靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB為材料，采用pH示差法、O.D.法和高效液相色譜法對9 種漿果中的總花色苷進行測定，并進行對比分析，擬為進一步開發(fā)利用大興安嶺地區(qū)藍靛果漿果資源提供數(shù)據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 大興安嶺地區(qū)野生藍靛果、栽培藍靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB（2018年6月20日采摘于大興安嶺地區(qū)農業(yè)林業(yè)科學研究院實驗基地藍靛果資源圃），放置于 20℃冰箱中保存。

標準品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（Cy3G）（美國Chromadex）；色譜純乙腈、甲醇（J＆K.SCITIFIC LTD.北京百靈威科技有限公司），色譜純甲酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、醋酸鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器設備 765 紫外可見分光光度計（INESA），上海精密科學儀器有限公司；BA110S精密電子天平，Sartorius儀器(上海)有限公司；UP-30 純水機，上海本昂科學儀器有限公司；沃特世e2695 高效液相色譜儀（Waters）；VOSHIN-1000DW超聲細胞破碎儀，無錫沃信儀器有限公司；DS-1 高速組織搗碎機，上海精科實業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藍靛果果實花色苷的提取 準確稱取勻漿后的樣品5g于150mL燒杯中，加入95%的乙醇:1.5mol/L的鹽酸為85:15(體積比)的提取劑100mL，靜止30min后，超聲15min兩次，合并抽濾液轉移至250mL容量瓶，濾渣加入30～40mL提取劑浸提3～4 次，過濾洗滌后用提取劑定容至250mL[8]。

1.2.2 O.D.法測定總花色苷含量 準確移取1.2.1 中提取液稀釋25 倍后在波長535nm處測定吸光值[8]，計算公式如下：

總花色苷含量 (mg/100g)=OD×DV×100×TEV/CrW×1/98.2

式中，OD為稀釋后溶液的吸光值；DV為稀釋倍數(shù)；TEV為提取液總體積；CrW為樣品質量(g)。

1.2.3 pH示差法測定總花色苷含量

1.2.3.1 緩沖液的配制。pH1.0 緩沖液：精密稱取1.49g氯化鉀，用蒸餾水定容至100mL，精密量取1.7mL鹽酸，用蒸餾水定容至100mL；將0.2mol/L氯化鉀與0.2mol/L鹽酸按體積比25:67 的比例混合，用氯化鉀溶液調節(jié)pH(1.0±0.1)。pH4.5 緩沖液:精密稱取1.64g乙酸鈉，用蒸餾水定容至100mL，用鹽酸調節(jié)pH(4.5±0.1)。

1.2.3.2 總花色苷含量測定方法。根據花色苷在pH1.0 時，在 520nm波長處有最大光吸收，而在pH4.5 時，花色苷轉變?yōu)闊o色查爾酮形式，在520nm波長處無吸收，所以可以利用pH示差法計算溶液中總花色苷的含量。準確移取1.2.1 中的提取液樣品1mL 2 份，將pH1.0 的氯化鉀和pH4.5 的醋酸鈉緩沖溶液分別定容至10mL，放置2h，在520nm和700nm處分別測定其吸光度，計算總花色苷含量(以矢車菊素-3-葡萄糖苷表示)[9]。計算公式如下:

總花色苷含量(mg/100g)=(A×V×n×M)/( ×m)×100

式中，A=pH 1.0－pH4.5；V為提取液總體積；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊-3-葡萄糖苷(Cy-3-Glu)的相對分子質量 (449)；為Cy-3-Glu的消光系數(shù) (29 600)；m為樣品質量(g)。

1.2.4 HPLC法測定總花色苷含量

1.2.4.1 色譜條件。色譜柱為島津C18 柱，4.6mm（內徑）×250mm（長）×5m（粒徑）?；ㄇ嗨兀òɑㄇ嗨剀蘸突ㄇ嗨剀赵┑臋z測波長為525nm。流動相組成為，A相：乙腈:甲醇=85:15；B相：10%甲酸水溶液。洗脫比例為：0min，8%A；15min，25%A；20min，8%A。柱溫35℃，流速0.8mL/min，進樣體積10L，采用waters 2489 UV檢測器，用empower（3.0 版本）軟件分析[10]。

1.2.4.2 標準系列。準確稱取矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品用2%的甲酸甲醇溶液定容稀釋至濃度為0.5mg/mL，分別稀釋至濃度為0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL。

1.2.4.3 樣品分析。取1.2.1 中提取液過0.45m濾膜后，按照1.2.4.1 中色譜條件進樣。通過檢測出的總峰面積與已知標準品的峰面積進行比對，計算出相對于標準品Cy3G的總花色苷含量和對應的矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量。

1.3 數(shù)據處理

采用Excel 2010 對上述數(shù)據進行處理，所有指標均進行了3 次平行樣測定。

2 結果與分析

2.1 花色苷標準曲線

見圖1、圖2和圖3。

圖1 標準品高效液相色譜圖

以5 個濃度系列為橫坐標，峰面積為縱坐標得到峰1 和峰2 對應的兩個擬合方程如下:

兩個方程擬合系數(shù)R2均接近于1，適合用于各藍靛果樣品中對總花色苷含量和對應的矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量的計算。

圖中由上往下依次為野生藍靛果、栽培藍靛果DN-2、BLY、DN-3、BL、EF、ED、RB、DN-1、矢車菊-3-葡萄糖苷標準（Cy3G）譜圖。

圖2 不同品種藍靛果果實中花色苷高效液相色譜法定量譜圖對比

圖3 不同品種藍靛果果實中花色苷高效液相色譜法重疊譜圖

由圖2、圖3 可以看出9 種藍靛果果實中都有矢車菊-3-葡萄糖苷單體，各種果實的色譜圖中看出峰的個數(shù)不同，野生藍靛果、栽培藍靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中峰的個數(shù)分別為 8、11、9、8、9、8、7、3、4，因此各種果實中花色苷種類不同。

2.2 藍靛果果實中總花色苷比較分析

見表1。

表1 藍靛果果實中總花色苷比較分析

由表1 可以看出，采用O.D.法測定野生藍靛果、栽培藍靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中總花色苷含量按照含量高低排序為DN-1 ＞BLY＞BL＞EF＞DN-2 ＞DN-3 ＞野生藍靛果＞ED＞RB；采用pH示差法測定野生藍靛果、栽培藍靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中總花色苷含量按照含量高低排序為DN-1＞BLY＞BL＞EF＞DN-3 ＞DN-2 ＞野生藍靛果＞ED＞RB；采用HPLC法測定野生藍靛果、栽培藍靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中總花色苷含量按照含量高低排序為DN-1 ＞BLY＞DN-3 ＞野生藍靛果＞DN-2 ＞BL＞EF＞ED＞RB；矢車菊-3-葡萄糖苷含量按照含量高低排序為DN-1＞BLY＞DN-3 ＞野生藍靛果＞DN-2 ＞BL＞EF＞ED＞RB；其中矢車菊-3-葡萄糖苷含量分別占pH示差法測定總花色苷含量的96.44%、70.77%、72.32%、48.34%、73.90%、35.99%、33.47%、27.83%、30.23%，按照比率高低排序為野生藍靛果＞DN-3 ＞DN-1 ＞BLY＞DN-2 ＞BL＞EF＞RB＞ED；矢車菊-3-葡萄糖苷含量分別占HPLC法測定總花色苷含量的 76.24%、68.86%、74.25%、73.08%、73.47%、73.63%、74.35%、71.06%、65.32%，按照比率高低排序為野生藍靛果＞EF＞DN-1 ＞BL＞DN-3 ＞DN-2 ＞ED＞BLY＞RB。

同時采用3 種方法測定，栽培品種DN-1 每百克中總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷的含量最高分別為502.991mg、363.75mg，其中矢車菊-3-葡萄糖苷占總花色苷含量的72.32%，與其他8 種藍靛果相比差異極顯著；栽培品種RB每百克中總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷的含量最低分別為 118.109mg、35.70mg，其中矢車菊-3-葡萄糖苷占總花色苷含量的30.23%。因此栽培品種DN-1 從花色苷含量角度來看有較高的營養(yǎng)價值，野生藍靛果居中，而RB營養(yǎng)價值較低。

圖4 藍靛果果實中不同方法測定花色苷含量對比

由圖4 可以看出，同一樣品用PH示差法測定藍靛果中總花色苷含量數(shù)值高于O.D.法測定結果，不同品種藍靛果中矢車菊-3-葡萄糖苷的含量各不相同，矢車菊-3-葡萄糖苷的含量占pH示差法測定總花色苷含量的比率也各不相同，不成正比例關系；矢車菊-3-葡萄糖苷的含量占HPLC法測定總花色苷含量的比率相近，最大差值為10.93%；根據HPLC總面積法測定野生藍靛果總花色苷含量高于PH示差法和O.D.法，測定栽培品種BLY、DN-1 和DN-3 中總花色苷含量與PH示差法基本一致，測定栽培品種DN-2、BL、EF、ED和RB中總花色苷含量均低于PH示差法和O.D.法，同時采用三種方法測定栽培品種ED和RB中總花色苷含量和矢車菊-3-葡萄糖苷單體含量都是最低的。EF、ED和RB中PH示差法和O.D.法測定總花色苷含量結果基本一致，均高于HPLC法；因此，O.D.法不適用于測定總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷含量高的果實。3 種方法測定結果的差異性可能與果實中色素和花色苷單體種類不同有關。

3 結論

大興安嶺地區(qū)每百克野生藍靛果中花色苷含量為273.25mg，高于伊春地區(qū)野生藍靛果的花色苷含量174.220mg[11]，大興安嶺地區(qū)栽培品種DN-1 中每百克花色苷含量為502.991mg，高于黑河栽培品種“加洛奇卡”花色苷含量322.64mg[12]，說明大興安嶺地區(qū)特殊的地理位置有利于藍靛果樹種中活性物質花色苷的積累；同時采用PH示差法、O.D.法和高效液相色譜法測定各品種之間總花色苷含量差異性顯著，花色苷含量豐富的果實宜采用PH示差法測定。栽培品種DN-1 中總花色苷含量最高，RB中總花色苷含量最低；為大興安嶺地區(qū)藍靛果的開發(fā)和利用提供了數(shù)據支撐，而每個品種中花色苷的具體類型是需要再進一步研究的課題。