雷雪峰　馬愛(ài)生　李海翠　王彩艷　劉紅媛

摘要：以來(lái)自?xún)?nèi)蒙古、寧夏、甘肅、新疆、四川、西藏等不同地區(qū)的8種禾本科牧草幼苗為材料，分別在15、5、0、-5 ℃ 下對(duì)其進(jìn)行低溫脅迫處理，研究其葉片細(xì)胞膜透性、丙二醛（MDA）含量、過(guò)氧化物酶（POD）活性、游離脯氨酸（Pro）及可溶性蛋白含量等生理生化指標(biāo)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明，隨著低溫脅迫加劇，8種禾本科牧草細(xì)胞膜透性、MDA含量總體呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，不同物種上升幅度存在差異;而在POD活性、Pro及可溶性蛋白含量方面，不同物種間變化幅度差異較大。通過(guò)隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)得出8種牧草抗寒性表現(xiàn)為細(xì)莖冰草>老芒 麥> 沙生冰草>蒙古冰草>多變鵝觀草>冰草>黑藥鵝觀草>大芒鵝觀草。

關(guān)鍵詞：禾本科牧草;低溫脅迫;生理響應(yīng);抗寒性

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）09-0218-05

我國(guó)擁有近4億hm2的天然草地[1-2]，但由于全球氣候變化及人類(lèi)對(duì)草地不合理的開(kāi)發(fā)利用，已普遍造成不同程度的草地退化，生產(chǎn)力嚴(yán)重下降[3-4]。再加上近年來(lái)草地超載過(guò)牧嚴(yán)重，草畜矛盾日益加劇，嚴(yán)重地制約著當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的快速發(fā)展[5]。只靠利用天然草地的養(yǎng)殖方式，已經(jīng)不適應(yīng)現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)快速發(fā)展的要求[6]。輔助人工草地建設(shè)是解決草畜矛盾、改善生態(tài)環(huán)境的重要手段。在我國(guó)北方草原地區(qū)，能否正常越冬是制約人工草地建植的關(guān)鍵問(wèn)題，因此亟需篩選抗寒性較強(qiáng)的牧草品種用于人工草地建植[7]。

禾本科牧草具備產(chǎn)量高、品質(zhì)好、適口性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，在草地畜牧業(yè)中發(fā)揮重要作用[8]。目前雖然對(duì)禾本科牧草抗逆性研究報(bào)道較多[9-12]，但對(duì)其跨區(qū)域的種間抗寒性評(píng)價(jià)研究報(bào)道則相對(duì)較少。因此，本研究擬對(duì)來(lái)自?xún)?nèi)蒙古、寧夏、甘肅、新疆、四川、西藏等不同地區(qū)的8種禾本科牧草幼苗進(jìn)行不同強(qiáng)度的低溫脅迫，分析其各相關(guān)生理指標(biāo)的變化情況，通過(guò)綜合分析，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行抗寒性評(píng)價(jià)，旨在為在我國(guó)范圍內(nèi)跨區(qū)域挖掘禾本科牧草抗寒材料，以及為寒區(qū)人工草地建植適宜品種篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來(lái)自于6個(gè)地區(qū)，包括禾本科3個(gè)屬8個(gè)種，材料具體情況見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016年9月至2017年1月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院進(jìn)行。試驗(yàn)采用盆栽育苗法，苗盆直徑為12 cm、高為15 cm，栽培基質(zhì)為農(nóng)田土和蛭石，兩者體積比為 2 ∶1，苗盆內(nèi)裝入等體積的混合栽培基質(zhì)，播種量為50粒/盆，盆栽材料全部置于25 ℃（白天）/20 ℃（晚上）的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。待苗高達(dá)10 cm時(shí)進(jìn)行低溫脅迫，脅迫設(shè)置4個(gè)水平（15、5、0、-5 ℃），并以室溫（25 ℃）作對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，各溫度脅迫時(shí)間為3 d。處理結(jié)束后，立刻剪取葉片稱(chēng)質(zhì)量，并用液氮迅速冷凍，放入-70 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)

細(xì)胞膜透性測(cè)定采用電導(dǎo)儀法;丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸顯色法;游離脯氨酸[HJ1.4mm]（Pro）含量測(cè)定采用茚三酮顯色法;過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚氧化比色法;可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法。

1.3 抗寒性綜合評(píng)價(jià)

抗寒性評(píng)價(jià)采用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合分析，其計(jì)算公式如下：

與抗寒性呈正相關(guān)的參數(shù)（POD活性、可溶性蛋白含量

和Pro含量）采用公式（1）：

U（Xijk）=（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。（1）

與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的參數(shù)（細(xì)胞膜透性、MDA含量）采用公式（2）：

U（Xijk）=1-（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。（2）

式中：U（Xijk）為第i個(gè)禾本科牧草第j個(gè)溫度階段第k項(xiàng)指標(biāo)的隸屬度，且U（Xijk）∈[0，1];Xijk表示第i個(gè)禾本科牧草第j個(gè)溫度階段第k項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定值;Xmax、Xmin分別為所有參試材料中第k項(xiàng)指標(biāo)的最大值、最小值。運(yùn)用公式（1）、公式（2）求出不同溫度處理下各禾本科牧草各指標(biāo)參數(shù)的隸屬函數(shù)值，再將其累加起來(lái)求其平均值，得出此指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)值。綜合評(píng)價(jià)值越大，則其抗寒性越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析、多重比較和抗寒性的隸屬函數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 禾本科牧草幼苗葉片的細(xì)胞膜透性變化

如圖1所示，隨低溫脅迫加劇，8種禾本科牧草幼苗葉片細(xì)胞膜透性總體呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，表明其細(xì)胞膜傷害程度逐漸加深。各低溫脅迫與對(duì)照（25 ℃）相比，8種牧草間幼苗葉片細(xì)胞膜透性存在一定差異。在15 ℃條件下，除多變鵝觀草及老芒麥外，其他6種牧草葉片細(xì)胞膜透性與對(duì)照相比，差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。在5 ℃條件下，除多變鵝觀草外，其他7種牧草幼苗葉片細(xì)胞膜透性與對(duì)照相比，差異均達(dá)到顯著或極顯著水平。之后，隨著脅迫的加劇，各牧草幼苗葉片細(xì)胞膜透性與對(duì)照相比，差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。其中，在0 ℃條件下，大芒鵝觀草葉片細(xì)胞膜透性增幅最大，為192.6%，多變鵝觀草葉片細(xì)胞膜透性增幅最小，為39.0%;在-5 ℃條件下，冰草葉片細(xì)胞膜透性增幅最大，為356.6%，多變鵝觀草葉片細(xì)胞膜透性增幅最小，為68.4%。上述分析表明，低溫脅迫對(duì)多變鵝觀草和老芒麥幼苗葉片細(xì)胞膜的傷害程度較小，對(duì)冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片細(xì)胞膜的傷害程度較大。

2.2 禾本科牧草幼苗的丙二醛（MDA）含量變化

如圖2所示，隨低溫脅迫加劇，8種禾本科牧草幼苗葉片MDA含量總體呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，表明其細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度逐漸加深。各低溫脅迫與對(duì)照（25 ℃）相比，8種牧草間幼苗葉片MDA含量存在一定差異。在15 ℃及5 ℃條件下，除沙生冰草、細(xì)莖冰草及多變鵝觀草外，其他5種牧草葉片MDA含量與對(duì)照相比，差異均達(dá)到顯著或極顯著水平。在 0 ℃ 條件下，沙生冰草及多變鵝觀草葉片MDA含量與對(duì)照相比，差異達(dá)到顯著（P<0.05）水平，其他6種牧草達(dá)到極顯著（P<0.01）水平，其中大芒鵝觀草和冰草MDA含量的增幅最大，分別為302.0%、200.0%。在-5 ℃條件下，各牧草葉片MDA含量與對(duì)照相比均達(dá)到極顯著（P<0.01）水平，其中，大芒鵝觀草和冰草MDA含量的增幅最大，分別為676.4%、490.0%，沙生冰草和細(xì)莖冰草MDA含量的增幅最小，分別為216.7%、106.3%。上述分析表明，低溫脅迫下沙生冰草和細(xì)莖冰草幼苗葉片膜脂過(guò)氧化程度較低，大芒鵝觀草和冰草幼苗葉片膜脂過(guò)氧化程度較高。

2.3 禾本科牧草幼苗的過(guò)氧化物酶（POD）活性變化

如圖3所示，隨著低溫脅迫加劇，黑藥鵝觀草和老芒麥幼苗葉片POD活性呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，其他6種牧草幼苗葉片POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中細(xì)莖冰草、冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片POD活性峰值出現(xiàn)在脅迫溫度為 5 ℃ 時(shí)，沙生冰草、蒙古冰草及多變鵝觀草幼苗葉片POD活性峰值出現(xiàn)在脅迫溫度為0℃時(shí)。各低溫脅迫處理與對(duì)照

（25 ℃）相比，8種牧草間幼苗葉片POD活性存在一定差異。在15 ℃條件下，細(xì)莖冰草、黑藥鵝觀草和多變鵝觀草幼苗葉片POD活性與對(duì)照相比，差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），其他5種牧草與對(duì)照相比差異不顯著。在5 ℃條件下，8種牧草間幼苗葉片POD活性與對(duì)照相比均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。在0 ℃條件下，細(xì)莖冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片POD活性與對(duì)照相比，差異不顯著，其他6種牧草與對(duì)照相比差異仍到達(dá)極顯著水平（P<0.01）。在-5 ℃條件下，冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片POD活性與對(duì)照相比，差異不顯著，其他6種牧草與對(duì)照相比差異仍到達(dá)極顯著水平（P<0.01）。上述分析表明，低溫脅迫下，冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片POD活性響應(yīng)較小。

2.4 禾本科牧草幼苗的游離脯氨酸（Pro）含量變化

如圖4所示，隨低溫脅迫加劇，冰草和大芒鵝觀草葉片Pro含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其他6種禾本科牧草幼苗葉片Pro含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。各低溫脅迫與對(duì)照（25 ℃）相比，8種牧草間幼苗葉片Pro含量存在一定差異。在15 ℃條件下，除沙生冰草、細(xì)莖冰草、蒙古冰草、大芒鵝觀草及多變鵝觀草外，其他3種牧草葉片Pro含量與對(duì)照相比，差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。在5 ℃條件下，除大芒鵝觀草外，其他7種牧草幼苗葉片Pro含量與對(duì)照相比，差異均達(dá)到極顯著（P<0.01）水平。之后，隨著脅迫的加劇，各牧草幼苗Pro含量與對(duì)照相比，差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），其中，在0 ℃條件下，細(xì)莖冰草和老芒麥葉片Pro含量增幅最大，分別為173.69%、164.10%，沙生冰草和冰草葉片Pro含量增幅最小，分別為69.50%、65.67%;在-5 ℃條件下，細(xì)莖冰草和多變鵝觀草葉片Pro含量增幅最大，分別為226.73%、207.50%，冰草和大芒鵝觀草葉片Pro含量增幅最小，分別為34.24%、65.36%。上述分析表明，低溫脅迫下，沙生冰草、細(xì)莖冰草、多變鵝觀草和老芒麥幼苗葉片Pro含量響應(yīng)較大，冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片Pro含量響應(yīng)較小。

2.5 禾本科牧草幼苗的可溶性蛋白含量變化

如圖5所示，隨著低溫脅迫加劇，細(xì)莖冰草、冰草、蒙古冰草、大芒鵝觀草和老芒麥幼苗葉片可溶性蛋白含量總體呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，其他3種牧草幼苗葉片可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中沙生冰草和多變鵝觀草幼苗葉片可溶性蛋白含量峰值分別出現(xiàn)在脅迫溫度為5、15 ℃時(shí)，黑藥鵝觀草幼苗葉片可溶性蛋白含量峰值出現(xiàn)在脅迫溫度為 0 ℃ 時(shí)。各低溫脅迫與對(duì)照（25 ℃）相比，8種牧草間幼苗葉片可溶性蛋白含量存在一定差異。在15 ℃條件下，除沙生冰草和冰草外，其他6種牧草幼苗葉片可溶性蛋白含量與對(duì)照相比，差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。在之后的脅迫溫度下，所有材料幼苗葉片可溶性蛋白含量與對(duì)照相比，差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。其中，在5、0、-5 ℃條件下，細(xì)莖冰草幼苗葉片可溶性蛋白含量增幅均最大，分別為134.3%、153.0%、173.9%，增幅較大的還有蒙古冰草，而冰草（27.9%、50.1%、54.6%）和老芒麥（35.6%、32.4%、61.2%）增幅最小，但其對(duì)照基數(shù)較大。

2.6 8種禾本科牧草幼苗抗寒性綜合評(píng)價(jià)

植物的抗寒性強(qiáng)弱是多種因子綜合作用的結(jié)果，因此，為了全面準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)供試材料的抗寒性，采用隸屬函數(shù)法得出各材料各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，進(jìn)一步求得各材料平均隸屬度，該值越大，抗寒性越強(qiáng)，反之抗寒性越弱。根據(jù)平均隸屬度（表2）得出8種禾本科牧草的抗寒性表現(xiàn)為細(xì)莖冰草>老芒 麥> 沙生冰草>蒙古冰草>多變鵝觀草>冰草>黑藥鵝觀草>大芒鵝觀草。

3 討論與結(jié)論

3.1 禾本科牧草低溫脅迫的生理響應(yīng)

低溫脅迫下，植物會(huì)發(fā)生一系列異常的生理生化反應(yīng)，其主要表現(xiàn)在細(xì)胞膜透性、活性氧含量、抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等的改變上，這些變化都是植物受到低溫脅迫后的傷害體現(xiàn)或應(yīng)對(duì)反應(yīng)[13-15]。

低溫脅迫對(duì)植物的傷害，首先表現(xiàn)為葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)受損，生物膜透性增加，電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率增大[16]。同時(shí)體內(nèi)活性氧的平衡被打破，導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化程度加劇，從而膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛含量增加。大量研究結(jié)果表明，隨著低溫脅迫強(qiáng)度的增加，早熟禾（Poa annua L.）、黑麥草（Lolium perenne L.）、高羊茅（Festuca elata Keng）[17-18]、老芒麥、偃麥草[Elytrigia repens （L.） Nevski.][19]及其他草坪草[20]等禾本科牧草的相對(duì)電導(dǎo)率、細(xì)胞傷害率及MDA含量都在增大，只是不同的物種變化程度不同。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果[17-20]一致，隨低溫脅迫加劇，供試的8種禾本科牧草幼苗葉片細(xì)胞膜透性及MDA含量總體呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，表明其細(xì)胞膜傷害程度逐漸加深。低溫脅迫對(duì)多變鵝觀草和老芒麥幼苗葉片細(xì)胞膜傷害程度較小，對(duì)冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片細(xì)胞膜傷害程度較大、膜脂過(guò)氧化程度較高。

低溫脅迫下，植物體通過(guò)調(diào)節(jié)保護(hù)酶活性，清除體內(nèi)過(guò)剩的活性氧自由基，減少有害物質(zhì)大量積累，進(jìn)而提高植物抗寒能力[21]。張尚雄等對(duì)3個(gè)披堿草屬（Elymus spp.）牧草的抗寒性研究表明，隨著低溫脅迫的加劇，保護(hù)酶SOD、POD活性隨之逐漸增強(qiáng)，不同抗寒性品種間保護(hù)酶活性增加幅度不同[22]。但楊順強(qiáng)等對(duì)從美國(guó)引進(jìn)的5種禾本科牧草研究表明，不同溫度處理下其根系SOD、CAT、POD的活性變化因種而異，大部分草種均是在冷凍處理后降到最低，返青后才有所回升[23-24]。本研究結(jié)果表明，隨著低溫脅迫加劇，黑藥鵝觀草和老芒麥幼苗葉片POD活性逐漸上升，其他6種牧草幼苗葉片POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)?？梢?jiàn)，低溫脅迫下，禾本科牧草保護(hù)酶活性的變化趨勢(shì)，與物種的遺傳特性、生存環(huán)境、低溫脅迫的強(qiáng)度以及組織器官等因素有關(guān)。

在干旱、低溫、高溫、鹽漬等各種逆境下，植物體均體現(xiàn)出水分脅迫的特征，多數(shù)植物可主動(dòng)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)提高細(xì)胞液濃度，降低滲透勢(shì)，提高細(xì)胞吸水或保水能力，從而適應(yīng)逆境脅迫。在抗寒性評(píng)價(jià)研究中，采用較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖，其中可溶性蛋白質(zhì)含量、脯氨酸含量與低溫脅迫關(guān)系的研究目前存在2種觀點(diǎn)：一種支持低溫導(dǎo)致植物細(xì)胞中該物質(zhì)含量變化趨勢(shì)是逐漸增加的;另一種認(rèn)為該物質(zhì)含量在抗冷過(guò)程中并不會(huì)發(fā)生改變，或者與植物抗冷性的增強(qiáng)并不存在因果關(guān)系[25]。本研究結(jié)果支持前一種觀點(diǎn)，即隨著低溫脅迫強(qiáng)度加劇，供試材料的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)表現(xiàn)為逐漸增加，只是部分材料在低溫脅迫后期滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加幅度降低。

3.2 植物抗寒性的綜合評(píng)價(jià)

不同的物種，其遺傳特性各異，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)方式不同，導(dǎo)致其抗寒機(jī)制存在差異[26-27]。從報(bào)道的文獻(xiàn)來(lái)看，抗寒性指標(biāo)主要有形態(tài)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)、分子指標(biāo)等[28]。但對(duì)植物進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià)時(shí)，絕大多數(shù)學(xué)者還是采用生理生化指標(biāo)。不同指標(biāo)對(duì)植物抗寒性的貢獻(xiàn)率不盡相同，正確評(píng)判各指標(biāo)的貢獻(xiàn)率，是植物抗寒性綜合評(píng)價(jià)的關(guān)鍵[29-30]。因此，應(yīng)采用多個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)分析植物的抗寒性，才能得出正確的結(jié)論。本研究采用了5個(gè)生理生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)隨著脅迫強(qiáng)度加劇，均體現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律，研究結(jié)果顯示與材料抗寒性有較高的相關(guān)性，因此在抗寒性綜合評(píng)價(jià)時(shí)未進(jìn)行權(quán)重分配。另外，研究發(fā)現(xiàn)，在模擬低溫脅迫處理時(shí)，脅迫方式、梯度、強(qiáng)度對(duì)抗寒性的評(píng)價(jià)結(jié)果也有影響，在相關(guān)報(bào)道中，有直接零下低溫脅迫，有零上低溫脅迫，有設(shè)置回溫處理。本研究采用25、15、5、0、-5 ℃的梯度脅迫處理方式，便于觀察植物表型變化與低溫脅迫強(qiáng)度的關(guān)系，可與試驗(yàn)結(jié)果相互參比。最終，本研究根據(jù)平均隸屬度得出8種禾本科牧草的抗寒性表現(xiàn)為細(xì)莖冰草>老芒麥>沙生冰草>蒙古冰 草> 多變鵝觀草>冰草>黑藥鵝觀草>大芒鵝觀草。

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