卜璐璐　趙凱　楊榮萍　羅興會(huì)　李清云　楊正安

摘要：以番茄自交系A(chǔ)C++和番茄母本材料1448的子葉為外植體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式接種于含有不同濃度玉米素（ZT）、吲哚-3-乙酸（IAA）和硝酸銀（AgNO3）的MS培養(yǎng)基上，以篩選適合番茄自交系A(chǔ)C++和1448的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA+3 mg/L AgNO3;誘導(dǎo)生根的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+0.3 mg/L IAA。

關(guān)鍵詞：番茄;農(nóng)桿菌介導(dǎo);再生體系;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)： S641.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）09-0096-04

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）作為具備良好加工特性的蔬菜，其普及性廣，口感好，營(yíng)養(yǎng)豐富，是植物口服疫苗的理想載體[1-2]。目前，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗愈加受到重視[3-4]。番茄作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)可食性疫苗具有較好的應(yīng)用前景，因此選擇較好的番茄遺傳轉(zhuǎn)化材料和優(yōu)化番茄的遺傳轉(zhuǎn)化體系顯得極為重要。

影響番茄遺傳轉(zhuǎn)化的因素有很多，大量研究表明，目前已開發(fā)出比較成熟的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系。但是不同基因型的番茄品種在相同的轉(zhuǎn)化條件下，其轉(zhuǎn)化率差異較大[5]。在番茄遺傳轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用得比較多的番茄品種為中蔬4號(hào)。葛艷輝等的研究表明，使用中蔬4號(hào)作為番茄遺傳轉(zhuǎn)化研究的品種，其轉(zhuǎn)化率可以高達(dá)51.40%，而在相同的體系下，T03的轉(zhuǎn)化率僅為28.17%[6-8]。以上研究結(jié)果表明，對(duì)于不同基因型的番茄，其最適的遺傳轉(zhuǎn)化體系不同，因此需要對(duì)不同基因型的番茄篩選出其最適合的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

本試驗(yàn)采用轉(zhuǎn)化效率比較高的番茄自交系A(chǔ)C++和1448作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出適合這2個(gè)品種的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系，并確定2種番茄材料中的最佳轉(zhuǎn)化材料，為后續(xù)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)番茄口服疫苗提供試驗(yàn)材料并奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄材料為番茄自交系A(chǔ)C++和筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的母本材料1448，分別由西南大學(xué)園藝園林學(xué)院和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院提供。

試驗(yàn)所用菌種（含有IGF-1基因的pCAMBIA2301-IGF-1載體）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2017年6月至2017年12月進(jìn)行，整個(gè)試驗(yàn)過程均在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院蔬菜分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無菌苗的獲取 挑選飽滿的番茄種子，加入洗潔精進(jìn)行搓洗（盡量去除其表面抑制種子發(fā)芽的物質(zhì)和種子表面的小茸毛），將種子清洗干凈。在超凈工作臺(tái)上完成以下操作。（1）種子的消毒處理。首先用75%乙醇消毒30 s，然后快速用無菌水清洗3次，之后加入飽和磷酸鈉溶液消毒20 min，再用無菌水清洗種子3次，其間不斷攪拌;加入有效濃度為2%的次氯酸鈉消毒10 min，其間稍作搖晃，用無菌水清洗5～7次，每次洗2 min。（2）種子消毒后的處理。將消毒的種子用無菌吸水紙吸干水分，然后將種子接種在1/2MS培養(yǎng)基中，每瓶接5～6粒種子。將培養(yǎng)基置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光—暗周期為16 h—8 h，光—暗溫度周期為26 ℃—18 ℃，光照度為1 500～2 000 lx，培養(yǎng)10～15 d左右獲得無菌番茄植株。

1.3.2 農(nóng)桿菌浸染番茄葉片 （1）選取培養(yǎng)7 d的番茄葉片，切成大小約為0.5 cm×0.5 cm的小塊，將葉片塊接種于如表1所示篩選好的固體培養(yǎng)基中，在黑暗條件下預(yù)培養(yǎng) 24～36 h。（2）將含有載體的農(nóng)桿菌接種于含有500 μg/L鏈霉素（Sm）、50 μg/L利福平（Rif）、50 mg/L卡那霉素（Kan）的液態(tài)酵母甘露醇培養(yǎng)基（YEB）中，28 ℃黑暗培養(yǎng)2 d。（3）取500 μL復(fù)壯后的農(nóng)桿菌加入液體YEB培養(yǎng)基（含有 500 μg/L Sm，50 μg/L Rif，50 mg/L Kan）中，過夜培養(yǎng)16 h，至D600 nm為0.5左右。（4）在室溫條件下于6 000 r/min離心10 min，用等體積的YEB重懸菌體;在室溫條件下于 4 000 r/min 離心10 min，棄上清，收集農(nóng)桿菌，用50 μL MS液體培養(yǎng)基重懸，作為浸染液。（5）將預(yù)培養(yǎng)的外植體浸泡在重懸的浸染液中10 min，其間振蕩，之后用濾紙吸去葉片上多余的菌液，放回原固體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)。每個(gè)處理接種10瓶，每個(gè)處理重復(fù)3次，每瓶接種6個(gè)葉片塊。（6）共培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的抗性培養(yǎng)基上，于光—暗周期為16 h（26 ℃）—8 h（18 ℃）的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2周更換1次培養(yǎng)基，直到愈傷組織生成。

1.3.3 誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽的培養(yǎng)基篩選 本試驗(yàn)采用3因素3水平，對(duì)番茄外植體葉片誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽的培養(yǎng)基進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)，以確定誘導(dǎo)愈傷組織和芽分化的最佳激素組合。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合見表1。

本試驗(yàn)以愈傷組織形成率（即出愈率，%）和不定芽分化率（%）來評(píng)價(jià)外植體的再生能力。接種21 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織數(shù)及形成率，42 d后統(tǒng)計(jì)出芽數(shù)及不定芽分化率，從而篩選出最適的誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基激素濃度。

愈傷組織形成率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%;

不定芽分化率=分化的不定芽數(shù)/接種的總外植體 數(shù)×100%。

1.3.4 不同培養(yǎng)基配方誘導(dǎo)番茄生根的試驗(yàn) 當(dāng)不定芽長(zhǎng)至3～4 cm左右時(shí)，切取生長(zhǎng)健壯的不定芽，分別插入含有0.2、0.3、0.4 mg/L IAA的MS生根培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種15株，誘導(dǎo)生根。1周后統(tǒng)計(jì)不同處理的生根數(shù)及生根率，并篩選出最適培養(yǎng)基。

生根率=生根的不定芽數(shù)/接種的總不定芽數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄自交系A(chǔ)C++的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果及分析

2.1.1 番茄自交系A(chǔ)C++的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果 番茄葉片經(jīng)過培養(yǎng)后，所有處理組合均有愈傷組織及再生芽生成，且不同處理組合形成愈傷組織和再生芽的情況不同。由表2可見，葉片的出愈率在23.68%～97.67%之間，以處理7組合的出愈率最高;芽的平均分化率在5.56%～86.05%之間，以處理1組合的芽平均分化率最低，而處理7組合的芽平均分化率最高。因此，以處理7組合作為誘導(dǎo)愈傷組織和芽分化的最佳處理組合，具體培養(yǎng)基配比為MS+3 mg/L AgNO3+0.5 mg/L IAA+2.00 mg/L ZT。

2.1.2 不同激素濃度對(duì)番茄自交系A(chǔ)C++生根的影響 挑選分化效果較好的番茄苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，用不同濃度的IAA對(duì)分化芽進(jìn)行處理，隨時(shí)觀察其生根動(dòng)態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種約4～5 d便可見根從小苗基部分化出來，10 d左右瓶中的小苗長(zhǎng)出1～2 cm的白色須根。

通過實(shí)際的試驗(yàn)觀察和表3的結(jié)果可以看出，番茄苗生根較為容易，一般1/2MS培養(yǎng)基都能獲得很好的效果，但是根較細(xì)長(zhǎng)，長(zhǎng)出的植株較弱。對(duì)同一時(shí)期的生根情況進(jìn)行比較可知，1/2MS+0.3 mg/L IAA誘導(dǎo)生根的生根率最高，達(dá)到100.00%，并且每個(gè)不定芽發(fā)生的不定根數(shù)量較多，根系粗壯，適于后期移栽工作。因此，選用1/2MS+0.3 mg/L IAA作為最佳生根培養(yǎng)基。

2.1.3 番茄自交系A(chǔ)C++的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果分析 由表4可以看出，平均出愈外植體數(shù)以處理7最高，達(dá)到42個(gè)，經(jīng)計(jì)算，其出愈率達(dá)到97.67%;進(jìn)一步分析表明，處理7與處理5、6、8之間的出愈外植體數(shù)差異相對(duì)不明顯。

由表5可以看出，AC++番茄外植體的芽分化結(jié)果表現(xiàn)為處理7的分化出芽外植體數(shù)最多，平均為37個(gè)， 經(jīng)計(jì)算芽分化率為86.05%;處理7與其他處理間差異明顯，處理6與處理7、5之間的芽分化結(jié)果差異明顯。

2.2 番茄母本材料1448的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果及分析

2.2.1 1448番茄的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果 由表6可見，對(duì)番茄母本材料1448的外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化后，所有處理組合均有愈傷組織產(chǎn)生，不同處理組合的出愈情況不同，其中以處理7的外植體出愈數(shù)最多，為32個(gè)，其出愈率為73.08%，出愈率最低的為處理1，僅為14.29%。1448番茄材料的芽分化率最高可達(dá)69.23%，其最適的芽分化與愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合為MS+3 mg/L AgNO3+0.5 mg/L IAA+2.00 mg/L ZT。

2.2.2 不同激素濃度對(duì)番茄母本材料1448生根的影響 挑選分化效果較好的番茄苗，轉(zhuǎn)入含有不同IAA濃度的生根培養(yǎng)基中，通過試驗(yàn)觀察和表7的結(jié)果可以看出，番茄苗生根較為容易，不添加激素的1/2MS培養(yǎng)基也可生根，但是根較細(xì)。對(duì)同一時(shí)期進(jìn)行比較可知，用1/2MS+0.3 mg/L IAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，其生根率最高，根系粗壯，生根率達(dá)到100.00%。因此，以1/2MS+0.3 mg/L IAA作為最佳生根培養(yǎng)基。

2.2.3 番茄母本材料1448的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果分析 對(duì)番茄母本材料1448外植體在不同處理下的出愈結(jié)果進(jìn)行分析，表8結(jié)果顯示，出愈效果最好的為處理7，與其他處理之間的差異明顯，處理3和處理4間的出愈外植體數(shù)差異明顯。

如表9所示，出愈數(shù)最高的處理組合7，其分化出芽外植體數(shù)也最多。處理7與其他處理組合之間的芽分化數(shù)差異明顯，此外，處理4、9和處理1、2、3之間差異明顯。

2.3 不同基因型番茄材料遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果的對(duì)比

由圖1、圖2可以看出，2個(gè)基因型番茄材料的出愈率、芽分化率最高的均為處理7，對(duì)于AC++番茄材料，最優(yōu)處理組合的出愈率為96.92%，芽分化率為86.15%。對(duì)于1448材料，最優(yōu)處理組合的出愈率和芽分化率明顯低于AC++材料。由圖1、圖2還可以看出，在使用處理組合4誘導(dǎo)愈傷組織以及誘導(dǎo)芽分化時(shí)，1448材料的出愈率和芽分化率要高于AC++，但是處理4不是2個(gè)材料中的最優(yōu)處理組合。綜合對(duì)2個(gè)基因型番茄材料的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果的對(duì)比得出，番茄自交系A(chǔ)C++為最佳遺傳轉(zhuǎn)化材料。

3 討論

3.1 不同基因型番茄材料對(duì)植株再生效率的影響

由本研究結(jié)果得出，植物的基因型不同，對(duì)培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同，植物的再生效率（即出愈數(shù)）具有顯著差異。本試驗(yàn)得出的結(jié)論與前人的研究結(jié)果一致。孫靖棣等選用5種不同基因型的番茄材料進(jìn)行再生體系調(diào)控研究，結(jié)果表明，不同基因型番茄的再生體系受不同激素配比的調(diào)控差異顯著[9]。裴華麗等以特大瑞光、菜都982F1和菜都六號(hào)3種番茄為試驗(yàn)材料進(jìn)行的研究結(jié)果表明，3種材料的分化率差異較大[10]。韋鵬霄等選用4種番茄材料進(jìn)行誘導(dǎo)花藥愈傷組織試驗(yàn)，結(jié)果得出，不同基因型番茄花藥對(duì)激素的敏感性不同[11]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，番茄自交系A(chǔ)C++的平均分化率最高可達(dá)到86.15%，比他人研究得出的其他品種的分化效率高。比如常用的番茄遺傳轉(zhuǎn)化材料中蔬4號(hào)，陳珍等篩選得出該基因型的遺傳體系轉(zhuǎn)化效率僅為51.4%[7]。

3.2 不同激素處理組合對(duì)外植體愈傷組織和再生芽形成以及根生長(zhǎng)的影響

番茄外植體分化愈傷組織和芽的能力取決于培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的種類和濃度比例。番茄組培中常用的細(xì)胞分裂素為6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和ZT，而張艷芳等的研究則以6-BA和IAA 2種激素進(jìn)行搭配組合，篩選毛粉802的最佳培養(yǎng)體系，結(jié)果顯示，2種激素的作用相同，但不同基因型的番茄應(yīng)該選擇其最適合的激素[12-13]。本試驗(yàn)采用ZT結(jié)合IAA、AgNO3進(jìn)行激素配比，篩選出適合誘導(dǎo)愈傷組織和再生芽的體系為MS+2.00 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA+3 mg/L AgNO3，培養(yǎng)基中添加的IAA濃度要比前人所用的濃度高。例如，王傲雪等以宇番一號(hào)和0949-46為試驗(yàn)材料，篩選出誘導(dǎo)子葉出芽的最佳激素組合中的IAA濃度為 0.2 mg/L[14]。這種情況可能是由不同基因型的番茄的內(nèi)源激素差異所造成的。

植物根系生長(zhǎng)的強(qiáng)弱直接關(guān)系到植株的生長(zhǎng)狀況[15]。本研究中誘導(dǎo)生根的最適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.3 mg/L IAA。研究表明，不添加激素的培養(yǎng)基也可以生根，但其根系生長(zhǎng)較弱。陳火英等用不同濃度的α-萘乙酸（NAA）、IAA、吲哚丁酸（IBA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）進(jìn)行生根培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，番茄的內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度較高，添加生長(zhǎng)素對(duì)不定芽發(fā)根有一定的作用，若不添加生長(zhǎng)素也極易發(fā)根[16]。

本試驗(yàn)對(duì)2個(gè)番茄品種的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了篩選，分別得到最佳的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并對(duì)2個(gè)材料的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，得出番茄自交系A(chǔ)C++材料的轉(zhuǎn)化效率要比1448材料的高。研究結(jié)果為后續(xù)研究口服疫苗提供了試驗(yàn)材料，并奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭 卿，郭書巧，葛才林，等. 轉(zhuǎn)基因番茄口服疫苗的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2010，5（1）：57-60.

[2]余云舟，王 罡，金寧一，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)gag基因和gp120基因轉(zhuǎn)化番茄的初步研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（4）：374-377.

[3]Koprowski H，Yusibov V. The green revolution：plants as heterologous expression vectors[J]. Vaccine，2001，19（17/18/19）：2735-2741.

[4]Daniell H，Streatfield S J，Wycoff K. Medical molecular farming：production of antibodies，biopharmaceuticals and edible vaccines in plants[J]. Trends in Plant Science，2001，6（5）：219-226.

[5]Sharma M K，Solanke A U，Jani D，et al. A simple and efficient Agrobacterium-mediated procedure for transformation of tomato[J]. Journal of Biosciences，2009，34（3）：423-433.

[6]葛艷輝，趙俊英，崔繼哲. 番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 吉林工程技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，23（6）：56-58.

[7]陳 珍，朱 誠(chéng). 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2008，34（6）：615-620.

[8]姜娜娜，趙傳志，趙光敬，等. 番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2012（1）：74-78.

[9]孫靖棣，未曉巍，蔡 蕊，等. 激素配比對(duì)不同基因型番茄再生體系的調(diào)控[J]. 北方園藝，2012（5）：115-118.

[10]裴華麗，李美芹，劉永光，等. 不同基因型番茄高效組培再生體系的建立[J]. 北方園藝，2013（3）：119-121.

[11]韋鵬霄，張 例，王茂昌，等. 不同激素組合對(duì)番茄溫敏核不育系及其雜交組合花藥愈傷組織誘導(dǎo)效應(yīng)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42（7）：700-704.

[12]張艷芳，霍秀文，蘇彩霞，等. 番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（3）：58-61.

[13]趙明珠，張美萍. 不同番茄品種再生體系的比較[J]. 北方園藝，2011（9）：127-129.

[14]王傲雪，趙 越，陳秀玲，等. 不同激素組合對(duì)番茄芽分化率的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，44（7）：85-90.

[15]姜麗娜，齊冰玉，徐光武，等. 水氮對(duì)根箱種植冬小麥根系生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（14）：42-45.

[16]陳火英，張建華，鐘建江，等. 番茄下胚軸離體培養(yǎng)植株再生及其組織學(xué)觀察[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2000，20（5）：759-765，圖版 Ⅰ-Ⅱ.