劉云峰，李海島，李 正，蔡 芳，徐飛鵬

益心舒片收載于《中國(guó)藥典》2015 版，由人參、麥冬、黃芪、五味子、丹參、川芎及山楂提取制成，具有益氣復(fù)脈、活血化瘀、養(yǎng)陰生津之功效[1]。臨床主要用于氣陰兩虛、瘀血阻脈所致的胸痹，證見(jiàn)胸痛胸悶、心悸氣短、脈結(jié)代，冠心病心絞痛見(jiàn)上述證候者。其中丹參是處方中主藥之一，丹酚酸B 是丹參中的主要藥效成分，也是益心舒片中的主要藥效成分之一。丹酚酸B 具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗不穩(wěn)定心絞痛、抑制肝纖維化、保護(hù)腎臟、抗腫瘤及防治糖尿病并發(fā)癥等藥理作用[2-6]。關(guān)于丹參提取物和中藥復(fù)方中丹酚酸B 的藥動(dòng)學(xué)研究已分別有報(bào)道[7-15]，而國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于丹參提取物及其復(fù)方制劑中丹酚酸B 的藥動(dòng)學(xué)差異比較的相關(guān)報(bào)道。為考察益心舒片中丹酚酸B 在體內(nèi)過(guò)程是否受中藥配伍的影響，本次研究對(duì)大鼠分別灌胃丹參提取物和益心舒片，通過(guò)藥動(dòng)學(xué)研究來(lái)闡明傳統(tǒng)中藥復(fù)方配伍具有一定的合理性和科學(xué)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)SD 雄性大鼠（江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重250～300 g。Waters e2695 型高效液相色譜儀（PDA 檢測(cè)器）；高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；BP211D 電子天平（Sartorius 公司）；微量移液器（Thermo 公司）；RE501 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（西安遠(yuǎn)艦儀器廠）；HH 恒溫水浴鍋（江蘇金壇市中大儀器廠）；渦旋震蕩器（江蘇金壇市中大儀器廠）；冷凍干燥機(jī)（賽飛公司）。甲醇（HPLC，honeywell 公司）；乙腈（HPLC，默克公司）；丹參提取物【自制，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)得丹酚酸B 含量為12.984 mg/g】；丹酚酸B 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111562-201514）；益心舒片（貴州信邦制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090491，批號(hào)：180703，RP-HPLC 法測(cè)定丹酚酸B 含量為2.839 mg/g；注射用水（江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司自制）；其余試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.5%甲酸水溶液（27 ∶7 ∶66）；流速：1.0 ml/min；柱溫30 ℃。

1.2.2 配制對(duì)照品溶液 取丹酚酸B 對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇稀釋制成每1 ml 含0.1012 mg 的溶液，即得。

1.2.3 丹參提取物的制備 稱取丹參藥材適量，加85%的乙醇加熱回流提取2次，第一次3 h，第二次1.5 h，濾過(guò)，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度約為1.12～1.15 的清膏，經(jīng)冷凍干燥后，備測(cè)。經(jīng)HPLC 法測(cè)得丹酚酸B 的含量為12.984 mg/g。

1.2.4 血漿預(yù)處理 采用微量移液器吸取血漿100 μl，加0.2 ml 甲醇，渦流振蕩2 min，13 000 r/min 高速離心7 min，取上清液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，備用。

1.2.5 藥動(dòng)學(xué)研究 隨機(jī)將12 只SD 雄性大鼠平均分成2 組，給藥前禁食12 h，可以自由飲水，實(shí)驗(yàn)前將丹參提取物和益心舒片（去薄膜衣后）分別用1%羧甲基纖維素鈉分散，灌胃給藥，給藥劑量按丹酚酸B折算均為60 mg/kg，并于給藥前和給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h 眼 眶 后靜脈叢取血，置EP 管中，按“1.2.4”項(xiàng)處理后測(cè)定。

1.2.6 藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 根據(jù)所獲得的血漿中丹酚酸B 的峰濃度Cmax及達(dá)峰時(shí)間Tmax，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均由Excel 2010 軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，其他藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用DAS 2.0 軟件進(jìn)行擬合處理，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性 分別取空白血漿、加入丹酚酸B 對(duì)照品的空白血漿、灌胃丹參提取物的血漿樣品及灌胃益心舒片的血漿樣品，按“1.2.4”項(xiàng)處理，分別進(jìn)針，色譜圖見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，分離效果好，專屬性強(qiáng)。

2.2 線性范圍、檢測(cè)限 精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下丹酚酸B 對(duì)照品溶液適量置1 ml 離心管中，加入100 μl 大鼠空白血漿，按“1.2.4”項(xiàng)處理對(duì)照品溶液，配制成丹酚酸B 濃度分別為0.253、0.506、1.012、2.530、5.060、10.120 μg/ml 的血漿樣品，進(jìn)樣分析，以測(cè)得的峰面積（Y）對(duì)血藥濃度（X）進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=74.752X+1537（r2=0.9996）（n=6），血漿中丹酚酸B 在0.253～10.120 μg/ml 之間呈良好線性關(guān)系，丹酚酸B 檢測(cè)限為0.063 μg/ml。

2.3 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取空白血漿100 μl 置于1 ml 離心管中，計(jì)18 份，分成三組，每組6 份，精密加入丹酚酸B對(duì)照品適量，按“1.2.4”項(xiàng)下方法操作，分別配制成1.012、2.530、5.060 μg/ml的3種濃度樣品，分別測(cè)定丹酚酸B 含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 精密度試驗(yàn) 取丹酚酸B 濃度為1.012、2.530、5.060 μg/ml 的3 種不同濃度的血漿樣品，分別日內(nèi)、日間各測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)、日間的精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 丹酚酸B 加樣回收試驗(yàn)（n=6，）

表1 丹酚酸B 加樣回收試驗(yàn)（n=6，）

加入量/μg·ml-1 測(cè)得量/μg·ml-1 回收率/% 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/% 1.012 0.979±0.024 96.74 2.45 2.530 2.467±0.039 97.51 1.58 5.060 4.963±0.081 98.08 1.63

表2 丹酚酸B 精密度試驗(yàn)（n=6）

表2 丹酚酸B 精密度試驗(yàn)（n=6）

加入量/ μg?ml-1日內(nèi) 日間測(cè)得量/μg·ml-1相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差/%測(cè)得量/μg·ml-1相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/% 1.012 0.982±0.025 2.55 0.977±0.028 2.87 2.530 2.483±0.042 1.69 2.474±0.044 1.78 5.060 4.974±0.087 1.75 4.953±0.089 1.80

圖1 丹酚酸B 在大鼠血漿樣品中的HPLC 色譜圖

2.5 提取回收率 取上述的丹酚酸B 濃度為1.012、2.530、5.060 μg/ml 的血漿樣品（n=6），按“1.2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)入色譜儀測(cè)定，得到丹酚酸B 平均峰面積A1；另取空白血漿100 μl，先不加對(duì)照品溶液，其他操作按“1.2.4”操作，得到上清液之后，向上清液中加入適量的丹酚酸B 對(duì)照品溶液，使丹酚酸B 濃度也分別為1.012、2.530、5.060 μg/ml 的樣品，分別進(jìn)入色譜儀，得到丹酚酸B 平均峰面積A2，計(jì)算3 個(gè)不同濃度的血漿樣品中丹酚酸B 的提取回收率（R=A1/A2×100%）。3 個(gè)不同濃度的提取回收率分別達(dá)到84.7%、87.9%和88.5%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.3%、2.6%和2.7%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取含有丹酚酸B 濃度為2.530 μg/ml的大鼠血漿樣本分別經(jīng)室溫即時(shí)測(cè)定、室溫放置24 h后測(cè)定、冷藏室內(nèi)（4℃）放置3 d 后測(cè)定、反復(fù)凍融3 次測(cè)定，以及零下20℃冷凍儲(chǔ)藏1 月測(cè)定，結(jié)果表明丹酚酸B 血漿樣品在各條件下均有良好穩(wěn)定性。

2.7 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 本次實(shí)驗(yàn)對(duì)得到的血藥濃度-時(shí)間的數(shù)據(jù)用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行擬合計(jì)算，其平均藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2，主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3，結(jié)果表明，丹參提取物和益心舒片中的丹酚酸B 在大鼠體內(nèi)的藥代過(guò)程非常類似，且益心舒片藥動(dòng)學(xué)參數(shù)更優(yōu)。

3 討 論

圖2 丹酚酸B 在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線

表3 丹酚酸B 在大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=6，）

表3 丹酚酸B 在大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=6，）

注：與丹參提取物組比，①P＜0.05

參數(shù) 益心舒片 丹參提取物 t1/2β（h） 0.182±0.133 0.194±0.176 t1/2Ka（h） 0.426±0.051① 0.612±0.056 AUC0 →t（μg·h·ml-1) 3.225±0.286① 1.775±0.403 AUC0 →∞（μg·h·ml-1) 3.397±0.293① 1.982±0.475 Tmax（h） 1 1 C max （μg·ml-1） 2.587±0.229① 1.723±0.172

在本研究中，方法具有良好的專屬性，空白血漿無(wú)干擾，丹酚酸B 與其他內(nèi)源性成分分離效果良好，且在此色譜條件下，血漿中丹酚酸B 的理論塔板數(shù)不低于2 500；血漿中丹酚酸B 在0.253～10.120 μg/ml 之間線性關(guān)系良好，血漿中丹酚酸B 檢測(cè)限為0.063 μg/ml，能很好地通過(guò)檢測(cè)要求；在實(shí)驗(yàn)中，分別于日內(nèi)和日間各測(cè)定5 次3 種不同濃度的血漿樣品，日內(nèi)及日間精密度均符合要求；本方法具有良好的提取回收率，滿足實(shí)驗(yàn)要求；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，丹酚酸B 血漿樣本在各條件下均有良好穩(wěn)定性。

實(shí)驗(yàn)前期，分別采用固相萃取法及有機(jī)溶劑蛋白質(zhì)沉淀法作為丹酚酸B 血漿樣品的預(yù)處理方法。多次比較后發(fā)現(xiàn)固相萃取法提取丹酚酸B，回收率較低，且與有機(jī)溶劑蛋白質(zhì)沉淀法相比，操作比較繁瑣，所以優(yōu)先選擇有機(jī)溶劑蛋白質(zhì)沉淀法。筆者還分別采用不同有機(jī)溶劑來(lái)處理血漿樣品，發(fā)現(xiàn)采用甲醇來(lái)沉淀血漿效果比較理想，且流動(dòng)相中本身含有甲醇，對(duì)檢測(cè)影響較小。在甲醇用量方面，發(fā)現(xiàn)甲醇用量的加大，血漿雜質(zhì)峰數(shù)量并沒(méi)有明顯減少，反而會(huì)影響丹酚酸B血漿樣品的測(cè)定，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，最終將血漿-甲醇的體積比確定為1 ∶2。本實(shí)驗(yàn)中采用甲醇沉淀蛋白提取丹酚酸B 的樣品前處理，操作簡(jiǎn)單、便捷、高效，符合藥動(dòng)學(xué)研究的要求。實(shí)驗(yàn)初期，采用2015 版中華人民共和國(guó)藥典一部所載的益心舒片中丹酚酸B 的測(cè)定方法，用于本次藥動(dòng)學(xué)研究中血漿樣品的丹酚酸B檢測(cè)，但通過(guò)前期的摸索研究，筆者嘗試微調(diào)了流動(dòng)相中有機(jī)相比例，丹酚酸B 與周圍的其他成分能很好地分離。筆者分別對(duì)兩組大鼠進(jìn)行灌胃給予丹參提取物和益心舒片后，丹酚酸B 的藥動(dòng)學(xué)研究顯示，灌胃益心舒片后，益心舒片中的中藥配伍能明顯影響丹酚酸B 在大鼠的體內(nèi)過(guò)程，具有明顯提高丹酚酸B 的生物利用度效果。

整體觀是中醫(yī)理論的基礎(chǔ)，中藥復(fù)方是中醫(yī)用藥的傳統(tǒng)精髓。由于中藥在臨床上辨證用藥均以復(fù)方為主，單味中藥的藥動(dòng)學(xué)研究難以代表復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)特征。研究復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)特征，應(yīng)以復(fù)方本身為研究對(duì)象，并考慮復(fù)方中的中藥配伍等關(guān)系，才能得到較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。本研究表明，丹參提取物和益心舒片中丹酚酸B 的藥動(dòng)學(xué)特征存在著較大差異，益心舒片中的其他配伍中藥成分可明顯增加丹酚酸B 在大鼠體內(nèi)的吸收，表明了中藥配伍給藥在臨床上確實(shí)有一定的合理性，配伍給藥能夠明顯改善某些有效成分的體內(nèi)吸收。在研究中，筆者也意識(shí)到復(fù)方制劑中僅以其中所含的個(gè)別成分的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果來(lái)斷定復(fù)方制劑的整體藥代動(dòng)力學(xué)特征，還缺乏相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，這也是今后需要在中藥復(fù)方制劑藥代動(dòng)力學(xué)研究中重點(diǎn)考慮的問(wèn)題。