王 娟，姜忠玲，豐艷妮，叢 霞，曹榮峰，田文儒，李華濤

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島266109)

在犬臨床輸血治療過程中,DEA1.1 和DEA1.2的抗原-抗體反應(yīng)是導(dǎo)致急性輸血性溶血的最主要因素[1],鑒定DEA1.1 血型是非常必要的。目前,在獸醫(yī)臨床上缺乏準確、簡便和便宜的犬血型鑒定試劑。由于犬的血型系統(tǒng)復(fù)雜[2-10],品種繁多[11-15],又缺乏強大的抗體制備和篩選技術(shù)。至今國際上存在的僅有Andrews 等在1992 年研制出了DEA1.1 血型定型單克隆抗體[16]。Hara 等1991 年研制出DEA3血型定型單克隆抗體,由于實驗室管理不善消失[17]。現(xiàn)如今,對犬血型可以用多克隆免疫抗體鑒定。但是所制備的多克隆免疫抗體必須用已知血型的試劑紅細胞篩查方可應(yīng)用于臨床。由于試劑紅細胞常規(guī)保存方法較短,而不同血型的紅細胞又很難收集并應(yīng)用到免疫血清和單克隆抗體的篩選中。所以,本研究欲建立一個更為簡單和敏感的方法,以作為不使用試劑紅細胞檢測犬DEA1.1 血型抗體的替代方法。

1 材料

1.1 樣品來源 血液樣本采自廣東及周邊地區(qū)養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的158 只實驗用比格犬,使用EDTA 抗凝。

1.2 試劑及儀器設(shè)備 DEA1.1 陽性抗原紅細胞:經(jīng)QuickVet/RapidVet Canine DEA1.1 Blood Typing Test 鑒定后紅細胞。DEA1.1 多克隆抗血清,購自加利佛尼亞國際動物血液資源庫?？谷甀gG 抗體,購自北京奧博森生物技術(shù)有限公司；凝聚胺介質(zhì)試劑盒,購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；HRP 酶標抗犬IgG 二抗,購自BD 公司。TMB 儲存液:稱取20 mgTMB(固體),加10 mL 無水乙醇,在37 ℃振蕩,使其充分溶解,-20 ℃保存?zhèn)溆谩５孜锶芤?TMBH2O2):取0.5 mL TMB 儲存液于10 mL 底物緩沖液,再加1 μL 30%H2O2,混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 方法

2.1 樣本DEA1.1 血型鑒定 采用凝聚胺介質(zhì)試劑抗球蛋白實驗檢測血型,將試管標號并分別加入犬抗DEA1.1 多克隆抗體100 μL 和5%DEA1.1 陽性紅細胞各1 滴。各加LIM 0.7 mL,混合均勻后,再各加Polybrene 溶液2 滴,并混合均勻。用BASO專用離心機1 000 r/min 離心10 s,倒掉上清液,讓管底殘留約0.1 mL 液體。輕輕搖動試管,目測紅細胞有無凝集,如無凝集,須重新制作。最后加入Resuspending 2 滴,輕輕轉(zhuǎn)動試管混合并同時觀察結(jié)果。如果凝集散開,表示是由Polybrene 引起的非特異性聚集,DEA1.1 血型抗體篩檢結(jié)果為陰性；如凝集不散開,則為紅細胞抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng),DEA1.1 血型抗體篩檢結(jié)果為陽性。

2.2 紅細胞膜的制備 將158 只犬采集的含有DEA1.1 抗原陰性和陽性的血液,按1∶10(v/v)的比例混于153.8 mmol/L NaCl 溶液(含抗凝劑EDTA 40.3 mmol/L)中。參照文獻描述的方法分離紅細胞膜[18],于-20 ℃下儲存直至使用。

2.3 Dot-ELISA 方法的建立 免疫斑點試驗是一種實驗室常用的簡單、重現(xiàn)性高的免疫診斷方法[19]。在本研究中,我們對該方法進行了改進,通過自制的環(huán)形固定器將硝酸纖維素膜(NCM)固定到96 孔板的孔底(圖1)。使用0.01 mol/L pH 值為7.4 的PBS 稀釋紅細胞膜,于96 孔板中每個NCM點樣2 μL,使斑點直徑為2 mm,并在37 ℃下干燥10 min。 用5%w/v 的脫脂奶粉封閉緩沖液,在37 ℃下靜置孵育20 min,阻斷NCM 上的非特異性結(jié)合位點。0.01 mol/L PBS(pH 值為7.4)洗滌4次。使用封閉緩沖液1∶200 稀釋抗DEA1.1 多克隆抗體,加入到該板的孔中,并于37 ℃抗孵育30 min。按上述方法洗滌4 次?？字屑尤肜备^氧化物酶標記的酶標二抗,然后將該板于37 ℃孵育30 min。按照TMB 試劑盒說明書加入顯色液,在37 ℃下避光反應(yīng)5 ～15 min,停止反應(yīng),用蒸餾水沖洗96 孔板。用相機記錄試驗結(jié)果。

圖1 固定硝酸纖維素膜到96 孔板孔中的模式圖

2.4 紅細胞膜中血紅蛋白殘留檢測 抗原包被濃度與所提取的紅細胞膜內(nèi)殘留的血紅蛋白含量有關(guān)。血紅蛋白可以和底物反應(yīng)顯色,抗原包被濃度較大可能會提高血紅蛋白殘留的含量,增加與血清中抗體進行非特異性結(jié)合的幾率,進而致使陰性血清出現(xiàn)斑點。所以在摸索過程中需設(shè)置不加血清只加底物顯色的試驗組,排除血紅蛋白殘留的干擾。結(jié)果顯示的沒有出現(xiàn)斑點或顏色變化的稀釋度,是確定抗原包被濃度時所用到的最大濃度。用0.01 mol/L PBS(pH 值7.4)2 倍倍比稀釋提取的紅細胞膜,每孔NCM 上點樣2 μL,置于37 ℃烘箱中干燥10 min。將Dot-ELISA 96 孔板用3%脫脂乳于37 ℃培養(yǎng)箱中封閉30 min。向板內(nèi)加入0.01 mol/L PBS(pH值7.4)振搖洗滌3 次,每次5 min,棄去液體拍干。向孔中加入一定系適度底物顯色溶液,避光振搖顯色5 ～10 min。蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。用相機記錄結(jié)果。

2.5 優(yōu)化細胞膜抗原濃度 將犬DEA1.1 陽性紅細胞膜2 倍倍比稀釋,2 μL 等份于NCM 上點樣,并在37 ℃下干燥10 min。封閉液1 ∶200 稀釋犬抗DEA1.1 多克隆抗血清和陰性血清。按照上述反應(yīng)程序進行檢測,最終優(yōu)化獲得最佳抗原濃度。

2.6 Dot-ELISA 的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性檢測 采用相同的抗原濃度,倍比稀釋待檢血清,用Dot-ELISA 檢測,并與抗球蛋白試驗結(jié)果相比確定其靈敏度。用陰陽性DEA1.1 犬紅細胞膜進行點膜,用DEA1.1 陽性血清檢測,觀察有無交叉反應(yīng)以確定其特異性。整個體系不變的情況下,將提取的紅細胞膜反復(fù)凍融20 次進行檢測,以及-20 ℃儲存11 個月后進行檢測,測試間接Dot-ELISA 方法的穩(wěn)定性。

2.7 臨床樣本驗證間接Dot-ELISA 檢測方法 采用間接Dot-ELISA 方法,用犬DEA1.1 血型抗血清對收集的158 條犬的血液樣本進行血型鑒定,結(jié)果與抗球蛋白試驗結(jié)果做對比。

3 結(jié)果及分析

3.1 血液樣本DEA1.1 血型抗體檢測 加入Resuspending 后,輕輕搖動試管,可明顯發(fā)現(xiàn)陽性血液仍保持凝集狀態(tài),陰性血液凝集散開。顯微鏡下觀察,發(fā)生凝集的血液紅細胞呈團塊狀存在,而未發(fā)生凝集的血液紅細胞呈單個存在。結(jié)果顯示,在158 只犬的血液樣本中,共計有12 只犬為DEA1.1陽性,146 只犬為陰性。

3.2 犬紅細胞膜DEA1.1 血型抗原鑒定及最佳作用濃度 提取的DEA1.1 血型陽性抗原(紅細胞膜),用間接Dot-ELISA 鑒定。提取的紅細胞膜可以保存犬血型DEA1.1 抗原,并用間接Dot-ELISA試驗鑒定,可與DEA1.1 陽性血清反應(yīng),與空白血清不反應(yīng)(圖2)。抗原的濃度越大越容易出現(xiàn)非特異性結(jié)合,即4 mg/mL 細胞膜處。陰性抗體血清顯示無色或沒有斑點出現(xiàn),陽性抗體血清顯示顏色最深的濃度為最佳的抗原包被濃度。提取的細胞膜在0.5 ～4 mg/mL 濃度,于硝酸纖維素膜上點樣2 μL,不出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。細胞膜濃度在0.5 mg/mL 時能非常明確的鑒定出細胞膜上抗原(圖2)。

圖2 犬紅細胞膜DEA1.1 血型抗原鑒定

3.3 犬紅細胞膜血紅蛋白殘留的檢測 試驗隨機挑選9 個樣本,由高到低共4 個濃度,點膜直接與TMB 顯色底物反應(yīng)。不同樣本由于提取細胞膜的過程中,血紅蛋白含量不一樣,因此顯色的顏色有差別,隨膜濃度的增高,顯示顏色也在加深,但是與抗體反應(yīng)后的陽性相比,差別非常明顯(圖3),說明我們提取的細胞膜血紅蛋白含量很低,完全能夠達到試驗的要求。

圖3 犬紅細胞膜血紅蛋白殘留的檢測

3.4 特異性試驗 用不同濃度的犬DEA1.1 陽性抗原和陰性抗原分別與陰性、陽性抗體抗血清反應(yīng),觀察間接Dot-ELISA 方法的特異性。結(jié)果顯示,具有相應(yīng)抗原的紅細胞膜,與陽性抗體抗血清反應(yīng),結(jié)果顯示深褐色斑點(+++),其他的無斑點(見中插彩版圖4),說明間接Dot-ELISA 檢測方法具有很高的特異性。

3.5 靈敏度試驗 一定濃度的犬DEA1.1 陽性抗原與不同稀釋度(倍比稀釋)的陽性抗血清反應(yīng),并與凝聚介質(zhì)試驗相比,觀察間接Dot-ELISA 方法的靈敏性。兩種方法相比,間接Dot-ELISA 方法比凝聚胺介質(zhì)試驗靈敏度高8 倍(見中插彩版圖5)。說明間接Dot-ELISA 方法具有很高的靈敏度,能檢測出弱抗體或濃度較低的抗體。

3.6 穩(wěn)定性試驗 紅細胞膜在-20 ℃長時間保存,反復(fù)凍融20 次,固定于Dot-ELISA 板4 ℃保存后進行檢測,觀察Dot-ELISA 方法的穩(wěn)定性。當紅細胞膜在-20 ℃保存11 個月時并不影響檢測結(jié)果,反復(fù)凍融20 次也不影響檢測結(jié)果。固定在Dot-ELISA 板4 ℃保存后發(fā)現(xiàn)2 個月內(nèi)不影響檢測結(jié)果(圖6)。說明Dot-ELISA 具有很高的穩(wěn)定性,可長期保存抗原,替換掉試劑紅細胞。

3.7 臨床樣本檢測 提取158 只犬紅細胞膜用DEA1.1 抗血清進行細胞抗原檢測。并與凝聚胺介質(zhì)試驗相比,觀察兩種方法的符合率。用DEA1.1抗原陽性的細胞膜對158 分犬血清進行DEA1.1 抗體檢測。臨床樣本檢測各個對比試驗顯示,符合率均為100%。說明Dot-ELISA 檢測方法可以用于抗體的篩查。

圖6 間接Dot-ELISA 方法穩(wěn)定性檢測

4 討論

Dot-ELISA 的基本原理與常規(guī)ELISA 和免疫酶染色法基本相同,即將抗原或抗體首先吸附在纖維素薄膜(如硝酸纖維素膜,NC)表面,并保持其免疫活性,通過與相應(yīng)的抗體或抗原和酶標記物的一系列免疫反應(yīng),形成酶標記抗原抗體復(fù)合物,在底物的參與下,結(jié)合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一種帶色物質(zhì),沉著于抗原抗體復(fù)合物吸附的部位,呈現(xiàn)出肉眼可見的顏色斑點。試驗的結(jié)果可通過顏色斑點的出現(xiàn)與否和色澤深度進行判定。

Dot-ELISA 在檢測和鑒定抗體方面比常規(guī)的血清學(xué)技術(shù)更加敏感[20],特別是用于檢測識別臨床意義抗體與傳統(tǒng)血清學(xué)檢測技術(shù)有相似或更高的靈敏性,可以用來檢測低濃度和弱親和力的抗體,增加了低濃度和弱親和抗體的檢測準確度。進一步改進了血型檢測方法和改善輸血安全。用于檢測抗體的紅細胞膜的抗原性可以在反復(fù)凍融和-20 ℃保存11 個月的條件下不受影響,說明此方法非常穩(wěn)定,并可以長時間保存血型抗原,解決了長期保存和運輸血型抗原問題。高穩(wěn)定性結(jié)果可提供更高的可靠性,從而進一步提高實驗室的標準化和控制程序。本研究建立的Dot-ELISA 方法,具有較高的準確性,臨床樣本的檢測結(jié)果與現(xiàn)有的檢測方法符合率較高。在本研究中環(huán)形固定器所起到的作用是可以把NCM 膜固定到96 孔板的底部。把整個紅細胞膜固定到酶標板上,建立檢測抗體的間接ELISA 方法,這樣可以用現(xiàn)在已經(jīng)商業(yè)化的ELISA 檢測分析儀器進行檢測,進而能夠達到自動化操作,節(jié)省人力,減少人為誤差和高通量檢測的目的。

總而言之,本研究所建立的Dot-ELISA 方法便捷易操作、準確、穩(wěn)定性高,可作為輸血前檢測的有效方法,從而避免傳統(tǒng)試劑紅細胞的使用。