1.昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院，云南 昆明 650100；2.云南大學(xué)教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091

柚皮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

骨碎補(bǔ)是水龍骨科植物槲蕨Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根莖，為我國(guó)常用中藥。其可療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨，外用亦可消風(fēng)祛斑；臨床上主要用于跌撲損傷、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動(dòng)等，外治斑禿和白癜風(fēng)等[1]。 除2015年版《中國(guó)藥典》收載的骨碎補(bǔ)外，歷代文獻(xiàn)中記載的骨碎補(bǔ)習(xí)用品有來(lái)源于3個(gè)科6個(gè)屬的10余種藥用植物[2]。目前從骨碎補(bǔ)中分離所得的化學(xué)成分主要涉及黃酮、三萜、酚酸及其的苷類等[3]，現(xiàn)行的藥典規(guī)定用高效液相色譜法測(cè)定其中主要成分柚皮苷的含量以控制其質(zhì)量[1]。本課題通過(guò)對(duì)比不同文獻(xiàn)與藥典記載的提取方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用微波提取法和具有創(chuàng)新性的實(shí)驗(yàn)型閃式提取器在不同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)同一種類骨碎補(bǔ)進(jìn)行有效成分的提取，并對(duì)提取效率進(jìn)行對(duì)比；同時(shí)對(duì)五種不同品種的骨碎補(bǔ)通過(guò)提取器經(jīng)相同條件提取其中有效成分，進(jìn)行柚皮苷含量大小的比較，旨在為骨碎補(bǔ)藥材的開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LC-Agilent 1100型高效液相色譜儀；中草藥粉碎機(jī)(FW135)；實(shí)驗(yàn)型閃式提取器(JHBE-50V)；ME204E/02電子天平；KQ-5200B超聲儀；XH-100A微波催化合成/萃取儀；甲醇為色譜純(Fisher)，乙腈為色譜純(Fisher)，甲酸為分析純，水為二次重蒸水。

1.2 材料 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司(純度≥98%)；骨碎補(bǔ)藥材由云南中醫(yī)藥大學(xué)提供，藥材均由云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院尹子麗老師鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)[1-2]以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)；流速：0.9 mL/min；溫度：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm，理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品6.3 mg，用甲醇溶解并于100 mL量瓶中定容，制成63.0 μg/mL的柚皮苷溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 微波法[4]選取一種骨碎補(bǔ)樣品(鱗軸小膜蓋)，用粉碎機(jī)粉碎3次，每次10 s。稱取藥材粗粉約0.50 g，精密稱定，置于三口燒瓶中。根據(jù)文獻(xiàn)和實(shí)際操作，加入甲醇∶水=2∶1的甲醇水溶液150 mL，微波協(xié)助提取70 ℃，保溫8 min(每分鐘暫停攪拌一下以保證有效成分充分溶解)，取出，冷卻至室溫，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.3.2 提取器提取法一 將骨碎補(bǔ)習(xí)用品用粉碎機(jī)粉碎3次，每次10 s。稱取藥材粗粉約10.00 g，精密稱定，于小燒杯中待用，精密加入分析純甲醇(≥99.8%)2 L于提取桶，倒入先前已精密稱定的藥材粗粉，開啟提取器提取2 min，用注射器取下層清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.3.3 提取器提取法二 將骨碎補(bǔ)習(xí)用品用粉碎機(jī)粉碎3次，每次10 s。取其中一種藥材(鱗軸小膜蓋)的粗粉約10.00 g，精密稱定，于小燒杯中待用，精密加入甲醇1400 mL和蒸餾水700 mL于提取桶，攪拌使兩者混合均勻，再倒入先前備用的藥材粗粉，開啟機(jī)器提取2 min，用注射器取下層清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液。

比較方法2.3.2和2.3.3的提取效率大小，擇優(yōu)對(duì)其他品種藥材進(jìn)行提取。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取柚皮苷對(duì)照品溶液2.5、3.5、5.0、7.5、10.0 μL依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以柚皮苷質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸得回歸方程為：y=1.6505×109x+62.03，R2=0.9958。結(jié)果表明柚皮苷進(jìn)樣量在157.5～472.5ng范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(鱗軸小膜蓋)10 μL，在2.1色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得柚皮苷峰面積RSD0.08%(n=3)，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液5 μL，分別間隔0、18、24h，在2.1色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得柚皮苷峰面積RSD1.00%，表明柚皮苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 對(duì)同一批骨碎補(bǔ)藥材(鱗軸小膜蓋)，按2.3.3供試品溶液的制備方法平行制備3份，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算柚皮苷含量，RSD1.31%(n=3)，表明此法重復(fù)性良好。

2.8 樣品含量測(cè)定 取不同種類的骨碎補(bǔ)的樣品，按2.3確定的方法分別依法制備，分別精密吸取供試品各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定柚皮苷的含量。結(jié)果表明所測(cè)定的5種樣品中，柚皮苷的含量差異較大，且兩種提取方法的提取效率不同。見表1和表2。

表1 同一骨碎補(bǔ)樣品(鱗軸小膜蓋)用不同方法提取柚皮苷的含量 (n=3)

(注：提取器提取法1中溶劑是純甲醇；提取器提取法2中溶劑是甲醇水溶液(甲醇∶水=2∶1)。兩者其他條件均相同。)

表2 不同品種骨碎補(bǔ)樣品柚皮苷的含量

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定不同來(lái)源的骨碎補(bǔ)藥材中有效成分柚皮苷的含量大小，對(duì)五個(gè)不同品種的骨碎補(bǔ)用新型的方法進(jìn)行測(cè)定，并選擇其中一個(gè)品種改變方法和溶劑作為對(duì)照。測(cè)定結(jié)果表明：不同產(chǎn)地不同品種的柚皮苷含量差異較大，同一提取方法和操作步驟所得的鱗軸小膜蓋中柚皮苷的含量最高為0.0618 μg/g，中華槲蕨、石蓮姜槲蕨和團(tuán)葉槲蕨中不含有柚皮苷；同種提取方法采用不同的溶劑提取也對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響，即用提取器提取時(shí)，對(duì)于同一藥材的樣品，純甲醇作為溶劑時(shí)提得的柚皮苷含量比以66.7%的甲醇水作為溶劑提取得的柚皮苷含量高近一倍；不同的提取方式對(duì)于柚皮苷的提取效率亦有影響，根據(jù)方婧等人[4]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論進(jìn)行些許調(diào)整所采用的微波法提取測(cè)得的柚皮苷含量比用新式的實(shí)驗(yàn)型閃式提取器提取同一批藥材所測(cè)得的柚皮苷含量高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，為0.5663 μg/g，但該含量相較于其他文獻(xiàn)所記載的[2,4-6]仍較低。

2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)骨碎補(bǔ)的含量測(cè)定項(xiàng)中規(guī)定[1]按干燥品計(jì)算，含柚皮苷(C27H32O14)不得少于0.50%。按規(guī)定，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的不同種類的骨碎補(bǔ)中柚皮苷含量均不合格，分析原因可能如下：實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地采用實(shí)驗(yàn)型閃式提取器進(jìn)行藥材有效成分柚皮苷的分離提取，該方法目前無(wú)文獻(xiàn)記載，故均按照其說(shuō)明書上所寫每次每種藥材均提取2 min。通過(guò)對(duì)比測(cè)定所得的數(shù)據(jù)計(jì)算得的結(jié)果推測(cè)，藥材中的有效成分柚皮苷可能并沒有被完全提取出，由此導(dǎo)致最終測(cè)定得的柚皮苷含量較低，之后在該方面的實(shí)驗(yàn)可改變提取器對(duì)藥材粉末進(jìn)行提取的時(shí)間和溶劑組成進(jìn)行研究。對(duì)中藥材的粉碎度大小對(duì)其中有效成分的浸出提取率亦可能有相當(dāng)影響，該方面也可作為一個(gè)研究方向進(jìn)行后續(xù)的深入探究。此外，配置對(duì)照品溶液時(shí)是用小燒杯先精密稱量再進(jìn)行定容，但小燒杯和樣品的質(zhì)量差異較大故產(chǎn)生的誤差也可能較大，從而影響標(biāo)準(zhǔn)曲線中峰面積相對(duì)應(yīng)的濃度的大小，進(jìn)而對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。

按文獻(xiàn)記載的微波法[4]提取所得的柚皮苷含量經(jīng)計(jì)算得的結(jié)果比文獻(xiàn)所記載的結(jié)果小了4個(gè)數(shù)量級(jí)，可能是受多方面因素影響的結(jié)果。文獻(xiàn)記載實(shí)驗(yàn)中考察溶劑對(duì)提取效率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)50%甲醇的提取率最高，而本實(shí)驗(yàn)中的溶劑是66.7%的甲醇；文獻(xiàn)考察提取溫度對(duì)柚皮苷提取效率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)120℃時(shí)提取率最高，而甲醇的沸點(diǎn)只有64.7℃，故本實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作時(shí)設(shè)置的微波溫度為70℃，可能會(huì)對(duì)提取結(jié)果產(chǎn)生影響；在保溫時(shí)間方面，文獻(xiàn)中得出的結(jié)論是柚皮苷在保留5 min后即已提取完全，故選定保留時(shí)間為5 min，而本實(shí)驗(yàn)因?yàn)樵O(shè)定的提取溫度比文獻(xiàn)中使用的低，故相應(yīng)的延長(zhǎng)對(duì)藥材粗粉的保溫時(shí)間至8 min，實(shí)驗(yàn)操作者猜測(cè)該項(xiàng)對(duì)柚皮苷提取率的影響應(yīng)較小。此外，不同種類和產(chǎn)地的骨碎補(bǔ)本身所含的柚皮苷含量可能本身就差異很大且質(zhì)量參差，如中華槲蕨、石蓮姜槲蕨等甚至不含柚皮苷。同一來(lái)源品種藥材的干燥程度、取藥部位、藥材本身的質(zhì)量也可能對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。

在用實(shí)驗(yàn)2.1項(xiàng)下的色譜條件前，先采用了現(xiàn)行的2015版藥典中規(guī)定的用于骨碎補(bǔ)含量測(cè)定的色譜條件下的流動(dòng)相，即甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)[1]，但結(jié)果十分不理想。進(jìn)行色譜條件的穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)時(shí)，連續(xù)進(jìn)標(biāo)樣測(cè)得的保留時(shí)間由14.56 min逐漸延長(zhǎng)至14.67 min，且24h后甚至延長(zhǎng)至17.39 min，遠(yuǎn)比大多數(shù)文獻(xiàn)[2,4,5]所寫的時(shí)間要久。此外，該流動(dòng)相對(duì)于柚皮苷的響應(yīng)值較小，進(jìn)樣量達(dá)10 μL時(shí)峰高也只有23.4，比文獻(xiàn)記載[4,6]的小了近一個(gè)數(shù)量級(jí)；而所出標(biāo)準(zhǔn)峰的對(duì)稱因子較大，進(jìn)樣量?jī)H7.5 μL時(shí)就已經(jīng)高達(dá)2.43；檢測(cè)來(lái)源于同一份提取液的第二三份供試品試液時(shí)甚至僅在3 min左右出現(xiàn)了一個(gè)雜峰，此外再無(wú)其他峰。按經(jīng)驗(yàn)推測(cè)，該結(jié)果可能與流動(dòng)相的酸性偏大及檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)已經(jīng)對(duì)液相柱造成一定壓力和損害有關(guān)。經(jīng)商討最終決定更換流動(dòng)相成分再進(jìn)行含量測(cè)定。

按前期的實(shí)驗(yàn)操作[2]中的色譜條件更換流動(dòng)相為乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)后，測(cè)定結(jié)果大大改觀，峰面積的響應(yīng)值與其他文獻(xiàn)記錄的相符，保留時(shí)間也相近，即在8 min左右出標(biāo)準(zhǔn)峰，且每次所出峰的對(duì)稱因子均小于1，色譜的穩(wěn)定性與重復(fù)性也較好。故本實(shí)驗(yàn)最終采用乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)作為液相色譜的流動(dòng)相。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)型閃式提取器對(duì)骨碎補(bǔ)的提取率低于微波提取，可見該種方法還不能被廣泛應(yīng)用于對(duì)中藥材標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定，設(shè)定的提取時(shí)間、溫度和溶劑都還有改進(jìn)提升效率的空間，這需要做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。此外，實(shí)驗(yàn)雖未完全按照藥典規(guī)定的方法對(duì)骨碎補(bǔ)進(jìn)行含量測(cè)定，但結(jié)果仍具有一定的參考價(jià)值。首先，藥典中的各檢測(cè)方法雖為國(guó)家規(guī)定的具有法律強(qiáng)制效力的標(biāo)準(zhǔn)，也有其不太合理的地方，比如本實(shí)驗(yàn)中的流動(dòng)相按藥典規(guī)定的比例配制，所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果十分不理想，當(dāng)然也可能與儀器性能跟不上有關(guān)。其次，藥典規(guī)定的提取方法操作較復(fù)雜，且提取時(shí)間過(guò)久，不利于質(zhì)檢所進(jìn)行實(shí)操；且有效成分的提取率受多方面影響，不能保證檢測(cè)時(shí)有效成分已完全提取出，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的實(shí)行仍存在一定問(wèn)題。