馮曉青 王 芹 汪 怡 王 露 宋 鑫 徐 瑞 杭學(xué)宇

(淮安市疾病預(yù)防控制中心，淮安 223001)

1 引言

有機(jī)磷(OPPs)農(nóng)藥在農(nóng)副產(chǎn)品中的濃度通常很低，蔬菜水果中存在的有機(jī)酸、色素以及糖類會(huì)造成基質(zhì)本底干擾，很多樣品不能直接上機(jī)分析，往往需要在樣品色譜分離檢測(cè)前，選擇富集能力較好或者可以較好地消除干擾、降低檢出限的前處理方法。目前，檢測(cè)果汁中農(nóng)藥殘留的樣品預(yù)處理技術(shù)主要有液液萃取(LLE)[1]、基質(zhì)固相分散(MsPD)[2-4]、固相萃取(SPE)[5]和固相微萃取(SPME)[6]等。液液萃取和固相萃取等傳統(tǒng)提取方法存在樣品和試劑消耗量大、操作繁瑣和耗時(shí)等缺點(diǎn)。近年來(lái)，由于具有操作簡(jiǎn)單、提取快速、無(wú)需溶劑、可實(shí)現(xiàn)提取自動(dòng)化等特點(diǎn)，SPME技術(shù)逐漸應(yīng)用于復(fù)雜樣品中農(nóng)殘富集的前處理。在SPME基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的攪拌棒吸附萃取(SBSE)技術(shù)通過(guò)用PDMS涂覆的攪拌棒攪拌預(yù)定時(shí)間來(lái)提取含水樣品[7]。聚二甲基硅氧烷具有性能穩(wěn)定、耐高溫、選擇范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，其作為SPME的涂層已應(yīng)用于多種農(nóng)殘的富集萃取。由于攪拌棒有比固相微萃取纖維更大面積的聚合物，所以可以得到較高的提取效率。通過(guò)冷進(jìn)樣系統(tǒng)和熱脫附實(shí)現(xiàn)半揮發(fā)性目標(biāo)化合物進(jìn)樣，可以有效排除基質(zhì)干擾。目前該技術(shù)已成功應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥和環(huán)境樣品等含有復(fù)雜基質(zhì)樣品的提取分析[8-10]。

本研究的主要目的是優(yōu)化并驗(yàn)證SBSE對(duì)復(fù)雜基質(zhì)水樣品中超痕量水平的不同辛醇-水分配系數(shù)的有機(jī)磷農(nóng)藥的富集萃取能力，另外建立SBSE-熱脫附(TDS)-氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定果汁中29種有機(jī)磷農(nóng)藥組分的方法，并用于實(shí)際樣品的分析檢測(cè)。

2 材料與方法

2.1 儀器

Agilent 7890B /5977A氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5MS色譜柱(美國(guó)Agilent公司)；攪拌棒、CIS-TDU熱脫附系統(tǒng)、Gestel TC2吸附管老化器(德國(guó)Gestel公司)；HJ-6B六聯(lián)磁力攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

2.2 試劑

29種有機(jī)磷農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(美國(guó)Accustandard公司)；甲醇(德國(guó)默克公司)；氯化鈉(分析純)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確吸取農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，用甲醇定容至10 mL，配成1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至盛有20 mL蒸餾水的頂空瓶中，加入攪拌棒，配制成濃度分別為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的29種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)系列。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1樣品前處理

將購(gòu)于淮安本地市場(chǎng)的葡萄、藍(lán)莓分別用榨汁機(jī)榨汁，過(guò)濾，離心?？紤]到樣品基體效應(yīng)可能帶來(lái)的干擾以及實(shí)際萃取過(guò)程中樣品量需求較大，將汁稀釋100倍再進(jìn)行萃取[11]。將攪拌棒置于20 mL頂空瓶中，向頂空瓶中加滿果汁樣品，放入攪拌棒，蓋緊蓋子，以700 r/min室溫下攪拌20 min，萃取完成后，取出攪拌棒，用少許蒸餾水洗滌棒表面，用不起毛棉紙吸干水分，放入熱脫附玻璃管中(4 mm×178 mm)，待TDS- GC/MS分析測(cè)定。

2.4.2儀器條件

攪拌棒老化：將攪拌棒(長(zhǎng)10 mm，PDMS膜厚0.5mm，萃取相涂層25 μL)裝入玻璃管后，放入磁子老化儀，通入氮?dú)?00 mL/min。老化程序：初始溫度40 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃保持30 min，再以10 ℃/min降至50 ℃保持0 min，25 ℃保持60 min。

熱解析條件：初溫50 ℃，延遲1 min，初始1 min，然后以200 ℃/min升至200 ℃保持10 min；傳輸線325 ℃，不分流模式，載氣流速為20 mL/min。冷阱條件：初溫-50℃，平衡0.2 min，初始時(shí)間0.01min，然后以12℃/s升至350 ℃保持10 min。

氣相色譜條件：色譜柱：DB- 5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm)(美國(guó)Agilent公司)；載氣：氦氣(純度>99.999%)；恒流：1.0 mL/min，PTV(progranned temperature vaporization)進(jìn)樣口，溶劑排空模式；程序升溫，初溫80℃保持1.0 min，以10 ℃/min 升溫至 130 ℃，保持 3 min， 12 ℃/min 升溫至 180 ℃，保持 0 min，7 ℃/min 升溫至 240 ℃，保持 0 min，12 ℃/min 升溫至 320 ℃，保持 10 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV；GC/MS傳輸溫度：280 ℃；溶劑延遲5 min，選擇離子掃描(SIM)模式。每個(gè)化合物選擇1個(gè)定量離子，29種有機(jī)磷類農(nóng)藥的保留時(shí)間和SIM掃描離子見(jiàn)表1。

表1 OPPs保留時(shí)間和SIM掃描離子

3 結(jié)果與討論

3.1 萃取體積和萃取時(shí)間

本實(shí)驗(yàn)考察了2 mL、5mL、10 mL和20 mL等不同樣品體積對(duì)不同ACD/LogP值(ACD軟件測(cè)定的脂水分配系數(shù))(1.66～5.07)的代表性有機(jī)磷農(nóng)藥萃取回收率的影響(圖1)。結(jié)果顯示所有目標(biāo)化合物的回收率隨著樣品體積的減少而不斷增加。當(dāng)樣品體積為最小的2 mL時(shí)得到的回收率最高。這主要是由于2 mL樣品有最小樣品/ PDMS相比(β= 83)[12,13]。此外，樣品越少地暴露于玻璃表面可以避免更多疏水性待測(cè)組份吸附到提取容器的玻璃壁上。然而，對(duì)于大多數(shù)化合物而言，實(shí)際提取量與樣品體積成正比，特別是ACD/LogP值在3～6范圍內(nèi)的有機(jī)磷化合物。為了獲得盡可能低的LOD，實(shí)際工作中選擇20 mL的樣品體積作為本研究參數(shù)。

圖1 不同體積萃取效率的回收率比較

萃取時(shí)間是SBSE萃取過(guò)程中的重要參數(shù)。通過(guò)分析上述流程處理的加標(biāo)樣品來(lái)評(píng)估其萃取有效性。圖2顯示了萃取時(shí)間與峰面積響應(yīng)之間的關(guān)系。當(dāng)萃取時(shí)間從20 min上升至60 min，峰面積有大幅增加。這表明在攪拌棒與樣品達(dá)到平衡之前，時(shí)間因素起關(guān)鍵作用。但當(dāng)萃取時(shí)間大于60 min后，大多數(shù)目標(biāo)化合物已經(jīng)達(dá)到平衡，因此，當(dāng)萃取時(shí)間發(fā)生較小變化時(shí)，對(duì)定量結(jié)果也不會(huì)產(chǎn)生較大影響。本研究中萃取時(shí)間選擇為60 min，然而在實(shí)際應(yīng)用中，由于靈敏度足夠高，可選擇適當(dāng)短的萃取時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)更快的分析速度和更高的分析通量。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)萃取量的影響

3.2 攪拌速度

攪拌可以加快分子質(zhì)量傳遞速率并縮短到達(dá)熱力學(xué)平衡所需的時(shí)間。研究考察了0～900 r/min范圍內(nèi)攪拌速度對(duì)目標(biāo)化合物提取效率的影響，結(jié)果顯示大多數(shù)目標(biāo)化合物的提取效率隨著攪拌速度從0 r/min到700 r/min逐步升高，但隨著攪拌速度的進(jìn)一步提高，回收率幾乎保持不變。另外考慮到過(guò)高的攪拌速度可能會(huì)損壞攪拌棒，在本研究中采用700 r/min的速度。

3.3 離子強(qiáng)度的影響

鹽增加溶液的離子強(qiáng)度，可以降低分析物在水相中的溶解度并促進(jìn)它們轉(zhuǎn)移到有機(jī)相[14]。已有報(bào)道稱，ACD/LogP值低于4.0的分析物通過(guò)加鹽可以顯著提高其回收率(SBSE法，添加30%NaCl)[15]。實(shí)驗(yàn)研究了添加NaCl在0%(無(wú)添加)、10%和30%水平下的對(duì)攪拌棒提取效率影響。對(duì)于ACD/LogP值在1～4之間的組分，加鹽可以提高其回收率，30%氯化鈉回收率最高，見(jiàn)圖3。相對(duì)于不添加鹽的SBSE方法，ACD/LogP值接近或大于4.0的有機(jī)磷農(nóng)藥回收率會(huì)顯著降低，所以要獲得滿意的回收效率必須增加額外的萃取時(shí)間?；趯?duì)快速分析方法的需要以及本研究中的目標(biāo)化合物ACD/LogP大多集中在4.0左右，所以本試驗(yàn)不添加氯化鈉。

圖3 不同鹽加入量萃取效率的比較

3.4 甲醇加入量

加入有機(jī)改性劑，如甲醇(MeOH)，有利于通過(guò)減少樣品瓶玻璃壁對(duì)目標(biāo)化合物的吸附來(lái)富集非極性化合物[16]。然而，有機(jī)改性劑的存在也增加了非極性化合物在溶液中的溶解度，降低了萃取效率。為了確定該效果，向50 ng/mL的空白加標(biāo)溶液中分別加入5%、10%、20%、30%的甲醇，考察不同甲醇加入量對(duì)萃取效率的影響。相對(duì)于ACD/LogP值較小的目標(biāo)化合物，加入甲醇會(huì)降低其回收率，而ACD/LogP值較大的目標(biāo)化合物適量的甲醇可以提高其富集效率，但效果并不明顯(圖4)。有研究證實(shí)一定比例的甲醇可改善ACD/LogP>6.0的農(nóng)藥組分的富集效率。鑒于本研究中目標(biāo)化合物ACD/LogP值均小于6.0，加之滿足方法簡(jiǎn)單快速等要求，本研究中不添加甲醇。

圖4 不同甲醇加入量萃取效率的比較

3.5 溫度

本研究分別在25 ℃、35 ℃、45 ℃、60 ℃下進(jìn)行攪拌萃取，考察不同溫度對(duì)萃取效率的影響。高溫有助于更快地達(dá)到平衡，但也降低了目標(biāo)化合物的分配系數(shù)和PDMS使用壽命[17]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著萃取溫度的升高，各組分的萃取效率均有不同程度下降，可能原因是有機(jī)磷農(nóng)藥在高溫下?lián)]發(fā)或高溫下分配系數(shù)降低引起。因此試驗(yàn)中選取室溫下進(jìn)行萃取操作。

3.6 GC-MS測(cè)定

29種OPPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg/L)和空白果汁加標(biāo)(5.0 mg/L)的總離子流圖(圖5)所示。各組分保留時(shí)間見(jiàn)表1。

圖5 29種OPPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白果汁加標(biāo)的總離子流譜圖(a).29種OPPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.0 mg/L)；(b).空白果汁加標(biāo)(5.0 mg/L)

3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、精密度及回收率

為考察果汁的基質(zhì)效應(yīng)，將葡萄汁和藍(lán)莓汁分別稀釋100倍作為為基體[18]，以空白基質(zhì)液配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線與以蒸餾水配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線作對(duì)比，結(jié)果顯示以空白基質(zhì)和蒸餾水配制的29種有機(jī)磷農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值在0.9～1.1之間，且峰面積響應(yīng)值也無(wú)差別，則認(rèn)定基質(zhì)效應(yīng)影響較小[19]，可采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量分析。

將1.3中所配制的29種有機(jī)磷農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)液按1.4.1和1.4.2條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度點(diǎn)平行測(cè)定3次，以響應(yīng)值平均值對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程見(jiàn)表2。29種可以有效萃取的OPPs的線性范圍在0.05～5.0mg/L之間，相關(guān)系數(shù)在0.96～0.99，在所研究的濃度范圍(0.05～5.0mg/L)內(nèi)，29種農(nóng)藥成分都具有較好線性關(guān)系。以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限，結(jié)果見(jiàn)表2。分別取不含有上述29種農(nóng)藥的空白果汁為溶劑，進(jìn)行低、中、高3個(gè)不同水平(0.05、0.5、2.0 mg/L)的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平平行檢測(cè)6次，3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率在70.9%～97.1%之間，RSD小于5.5%(表3)，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表2 29種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

續(xù)表2

表3 空白果汁中29種OPPs的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差( n = 6)

續(xù)表3

3.9 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)20份果汁樣品進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，均未檢出。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了攪拌棒吸附萃取(SBSE)-熱脫附(TDU)-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定果汁中29種有機(jī)磷類農(nóng)藥(OPPs)殘留的方法。本方法能有效萃取分配系數(shù)(ACD/LogP>1.0)的組分、無(wú)有機(jī)溶劑污染、操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高、精密度好、線性好、能滿足有機(jī)磷類農(nóng)藥多殘留同時(shí)檢測(cè)分析的要求，為果汁樣品中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留分析提供了可靠的檢測(cè)手段，也為有機(jī)磷類及其他農(nóng)藥品種的檢測(cè)提供了參考依據(jù)。