李青梅 高芳 韓姣 孫悅 趙吉勝 陳士剛

摘要：體胚發(fā)生具有遺傳穩(wěn)定、繁殖快、數(shù)量多結(jié)構(gòu)完整等優(yōu)點，為云杉屬樹種細(xì)胞分化和全能性表達(dá)提供較為理想的理論體系。體胚發(fā)生的影響因素主要有，外植體的部位及所處生理時期、基本培養(yǎng)基的種類、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類與濃度、糖的種類與濃度、以及培養(yǎng)條件等，不同因素對體胚發(fā)生的影響也不盡相同。本文綜述了云杉屬樹種體胚發(fā)生的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：云杉屬;體胚發(fā)生;再生植株;胚性愈傷組織

云杉屬樹種具有適應(yīng)性強、抗逆速生等優(yōu)點，是園林綠化與用材的重要樹種。云杉屬樹種傳統(tǒng)的繁殖方法為種子繁殖和扦插繁殖，種子繁殖存在繁殖周期長，優(yōu)良遺傳基因退化以及遺傳性狀不穩(wěn)定的現(xiàn)象，且云杉屬樹種生長緩慢，一般要4～5年才能獲得可移栽的苗木。而扦插繁殖存在繁殖系數(shù)與成活率低等問題。在云杉屬樹種的育種工作中，利用體胚發(fā)生技術(shù)與傳統(tǒng)的繁殖技術(shù)相結(jié)合，能夠較好的解決這些問題。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指雙倍體或單倍體的體細(xì)胞（非合子細(xì)胞）在特定條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過與合子胚胎發(fā)生類似的途徑發(fā)育出新個體的形態(tài)發(fā)育過程。具有遺傳穩(wěn)定、繁殖快、數(shù)量多、結(jié)構(gòu)完整等優(yōu)點，并且具有以低成本繁育出大量高品質(zhì)苗木的潛能。體胚發(fā)生技術(shù)在云杉屬樹種應(yīng)用較為廣泛，該技術(shù)為云杉屬樹種的品種改良和規(guī)模化繁殖提供較為理想的技術(shù)平臺，本文綜述了云杉屬樹種體胚發(fā)生的現(xiàn)狀、影響因素及當(dāng)前存在的問題，以便為云杉屬樹種建立高效的體胚發(fā)生體系提供借鑒。

1 云杉屬樹種體胚發(fā)生的研究現(xiàn)狀

云杉屬樹種全世界約40種，我國云杉屬樹種資源豐富，有16種9變種。1985年Hakman等首次報道了挪威云杉體胚發(fā)生并獲得再生植株，使云杉屬樹種體胚發(fā)生體系有了質(zhì)的飛躍。經(jīng)過近30年的研究，白云杉、黑云杉、紅云杉、歐洲云杉、庫頁云杉、西加云杉、恩氏云杉、塞爾維亞云杉等云杉屬樹種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)已有報道。從20世紀(jì)80年代以來，國內(nèi)相繼對原產(chǎn)我國的云杉屬樹種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行了研究，其中，青杄、白杄、紅皮云杉、沙地云杉、麗江云杉的體細(xì)胞胚胎發(fā)生究已有報道;其中挪威云杉、白云杉、黑云杉體胚發(fā)生獲得了較為深入的研究，并且已經(jīng)大規(guī)模的應(yīng)用于造林實踐中，帶來了巨大的生態(tài)和經(jīng)濟效益。目前，挪威云杉作為云杉屬樹種的模式植物已經(jīng)開展了從細(xì)胞學(xué)水平到分子水平的全面探索，特別是全基因組測序圖譜的完成，對于闡明云杉屬樹種體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其調(diào)控機制將發(fā)揮巨大作用。

2 體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程

植物體胚發(fā)生方式可分為兩種，即直接體胚發(fā)生和間接體胚發(fā)生。直接體胚發(fā)生即從外植體上直接誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，間接體胚發(fā)生即需要經(jīng)過胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段，就目前對國內(nèi)外云杉屬樹種的研究，屬于間接體胚發(fā)生，其發(fā)育階段分別為：愈傷組織誘導(dǎo);愈傷組織保持與增殖;體細(xì)胞胚的發(fā)育與成熟;體細(xì)胞胚的萌發(fā)與植株再生;再生植株的移栽。

3 云杉屬體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程影響因素

3.1 愈傷組織誘導(dǎo)過程中的影響因素

外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響：根據(jù)細(xì)胞全能性理論，植物任何細(xì)胞、組織、器官在適宜條件下，都有發(fā)育出完整新個體的可能，對許多樹種的研究表明，以未成熟胚為外植體較成熟胚具有更大的潛能。在云杉屬樹種中以未成熟合子胚成功實現(xiàn)體胚發(fā)生的居多。外植體的生理狀態(tài)也是極為重要的，因為外植體會隨著生長季節(jié)而逐漸喪失胚胎發(fā)生的能力，在培養(yǎng)過程中，應(yīng)采集胚胎發(fā)生較強生理狀態(tài)的外植體。同時外植體的基因型對云杉屬樹種體胚發(fā)生影響較大，不同無性系外植體的同一采集時期和同一無性系的不同采集時期均會對試驗效果產(chǎn)生巨大的影響。

培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響：基本培養(yǎng)基的成分和狀態(tài)對體細(xì)胞胚胎發(fā)生至關(guān)重要。云杉屬樹種體胚發(fā)生培養(yǎng)基較多，包括mLV、1/2mLV、LM、MS、1/2MS、改良P6培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基的選擇影響體胚發(fā)生的培養(yǎng)效果，不適宜的培養(yǎng)基會導(dǎo)致誘導(dǎo)效果差甚至?xí)?dǎo)致試驗的失敗。在培養(yǎng)基中氮素的形態(tài)對體胚發(fā)生起著重要的作用，通常在含有較高濃度的NH4NO3的培養(yǎng)基對體胚發(fā)生不利，明顯降低NH4+和NO3-的濃度有利于提高體胚發(fā)生率。在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中是鉀離子對體胚發(fā)生是必須的，鉀離子是維持陰陽離子平衡的主要離子。在低氮素條件下，不適當(dāng)?shù)拟涬x子濃度的影響特別明顯。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)的影響：研究表明，影響體細(xì)胞分化的因素很多，但其中最重要的是植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。生長素是研究體胚發(fā)生最多的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在不少植物中已經(jīng)證明是胚胎發(fā)生所必需的。2，4-D和NAA是針葉樹種體胚發(fā)生較常用的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。細(xì)胞分裂素在云杉屬樹種中也起到很重要的作用，常用的細(xì)胞分裂素有KT、TDZ和6-BA。其中6-BA作為常見。生長素和細(xì)胞分裂素的種類與濃度對云杉屬樹種體胚發(fā)生具有重要的影響，二者的濃度過高或過低或比例不當(dāng)聚會對試驗效果產(chǎn)生重要的影響。因此在試驗過程中，應(yīng)該妥善處理植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類與濃度，以便達(dá)到更好的效果。

環(huán)境因子對愈傷組織誘導(dǎo)的影響：環(huán)境因子對體胚發(fā)生的影響也較大，環(huán)境因子、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)容器和培養(yǎng)狀態(tài)均會對體胚發(fā)生的效果產(chǎn)生重要的影響。國內(nèi)外云杉屬樹種體胚發(fā)生過程中，一般采用暗培養(yǎng)的研究方法。云杉屬樹種的體胚發(fā)生可以采用液體或固體的培養(yǎng)方法，但以固體培養(yǎng)基居多。

3.2 愈傷組織增殖過程中的影響因素

云杉屬樹種胚性愈傷組織的保持與增殖一般在生長素與細(xì)胞分裂素的共同參與下進(jìn)行，生長素以2，4-D和NAA最為常見，細(xì)胞分裂素是以6-BA最為常見。在此過程中，一般要降低植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度，繼代周期以2周左右為宜，既能保持胚性愈傷組織的胚性，又能獲得較大的增殖量。

3.3 體胚發(fā)育與成熟過程中的影響因素

體胚發(fā)育與成熟階段一般在提高了滲透壓的培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行，在云杉屬樹種中選用PEG4000居多，脫落酸（ABA）是一種天然的植物生長調(diào)節(jié)劑，ABA對體胚發(fā)生，尤其是對體胚成熟特別重要。研究表明ABA能夠抑制胚的過早萌發(fā)對云杉屬樹種體胚成熟具有重要的影響，國內(nèi)外成功實現(xiàn)體胚發(fā)生的云杉屬樹種均在培養(yǎng)基中加入了ABA，ABA的主要作用是促進(jìn)體胚成熟，減少畸形胚的產(chǎn)生，抑制體細(xì)胞胚的過早萌發(fā)，防止針葉樹種的裂生多胚現(xiàn)象。在云杉的研究中發(fā)現(xiàn)ABA能夠促進(jìn)體細(xì)胞胚的脂類和蛋白體的積累，因而促進(jìn)體胚的成熟。

3.4 體胚的萌發(fā)與植株再生過程中的影響因素

體胚萌發(fā)即成熟的體細(xì)胞胚在適宜條件下發(fā)育成新的植株，包括成熟體胚的生根以及胚軸和子葉的伸長。云杉屬樹種體胚萌發(fā)與植株再生過程一般以WPM和MS為基本培養(yǎng)基，在此過程中一般降低蔗糖的濃度，撤除植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，添加低濃度的活性炭以提高植株再生率。關(guān)于體胚的萌發(fā)狀況，不同的植株之間存在很大的差異。因此，在體胚萌發(fā)過程中，選取發(fā)育優(yōu)良的植株使很有必要的。

4 展望

體胚發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，包括一系列的生理生化反應(yīng)和復(fù)雜的器官發(fā)生反應(yīng)，同時影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的因素很多，從而給體胚發(fā)生技術(shù)的研究帶來了巨大的困難。在今后的研究中，需要在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步深化研究，要利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)分離與胚性發(fā)育相關(guān)的基因，進(jìn)一步揭示云杉屬體細(xì)胞胚胎發(fā)生分子機理及其調(diào)控機制，建立更多高效穩(wěn)定的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生體系。這些研究將為云杉屬樹種種質(zhì)資源的保護(hù)提供理論依據(jù)，為體細(xì)胞胚胎發(fā)生在林業(yè)生產(chǎn)中的實際應(yīng)用作出貢獻(xiàn)。

基金項目：吉林省公益性科研院所行業(yè)科研項目（GY-2018-06）。

作者簡介：李青梅（1980-），女，副研究員。主要從事林木育種和生物技術(shù)研究工作。

通訊作者：陳士剛（1976-），男，研究員。主要從事林木育種和生物技術(shù)研究工作。