偶健，王瑋，倪夢霞，鄭愛燕，丁潔，蒲艷，鄒琴燕，孟慶霞，許詠樂，李紅

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

染色體易位是常見的染色體結(jié)構(gòu)異常。人群中相互易位的發(fā)生率約為1/1 000～1/500，羅氏易位的發(fā)生率約為1/1 000～1/900，而在不育及反復(fù)自然流產(chǎn)患者中，易位的發(fā)生率達(dá)1%～10%[1]。染色體易位攜帶者在減數(shù)分裂過程中，易位的染色體和正常的染色體之間按照不同的分離重組產(chǎn)生高比例的不平衡配子[2-4]，羅氏易位攜帶者異常的胚胎占2/3，而相互易位攜帶者異常比例高達(dá)80%[2]，這是導(dǎo)致其反復(fù)流產(chǎn)、胚胎停止發(fā)育、生育智力低下或畸形胎兒的主要原因。

羅氏易位攜帶者在形成配子的過程中，除了影響與易位相關(guān)的染色體的分離外，還會影響其它非相關(guān)的染色體的分離，其形成原因被認(rèn)為是染色體相互效應(yīng)(interchromosomal effects，ICE)所導(dǎo)致[3]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)在相互易位攜帶者中同樣也會發(fā)生新發(fā)染色體異常[4]。本研究的目的在于分析植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)中這種可能源自ICE的新發(fā)染色體異常對易位攜帶者胚胎診斷結(jié)果和臨床結(jié)局的影響。

資料和方法

一、研究對象

選取27對羅氏易位攜帶者夫婦(共27個周期)(表1)和53對相互易位攜帶者夫婦(共64個周期)(表2)采用二代測序(next generation sequencing，NGS)行PGD。納入標(biāo)準(zhǔn)：夫婦一方為染色體相互易位或者羅氏易位的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：同源染色體易位患者；女方BMI>28 kg/m2。所有患者的染色體易位均由外周血染色體常規(guī)G顯帶確認(rèn)。女方年齡21～43歲，平均年齡29.8歲。所有夫婦均簽署了體外受精(IVF)和PGD知情同意書，醫(yī)院生殖倫理委員會對此研究項目通過倫理審查。所用胚胎均由患者簽訂知情同意用于科研。

表1 羅氏易位攜帶者信息

二、研究方法

1.胚胎培養(yǎng)及活檢：采用本中心常規(guī)方案[5]進行。

2.胚胎活檢細(xì)胞全基因組擴增(WGA)：采用英國BlueGnome公司針對單細(xì)胞的SurePlex WGA Kit。包括細(xì)胞裂解DNA片段化、擴增前處理和擴增三個步驟。為避免污染，此過程需全部在專用超凈臺內(nèi)進行。WGA的DNA質(zhì)量檢測采用Life Qubit 3.0 Fluorometer檢測。

3.二代測序(NGS)：采用美國Life Tech公司的ION XPRESS LIBRARY試劑盒構(gòu)建測序文庫。取100 ng WGA產(chǎn)物加入buffer和Enzyme MIX Ⅱ 37℃ 35 min進行片段化處理，之后純化采用美國Beckman公司的Agencourt?AMPure?XP beads，洗脫后加連接頭Ion XpressTMBarcode 1，后再純化，使用E-Gel?SizeSelectTM2% 瓊脂糖凝膠電泳后回收200 bp的片段，PCR擴增后再純化，使用Ion PGMTM Template OT 2 200 Kit試劑盒對文庫DNA進行擴增，后開始測序，程序設(shè)定中測序Flow數(shù)量選擇260 Flows，參考基因組選擇hg 19，Ion Xpress選擇barcode1。

表2 相互易位攜帶者信息

4.測序數(shù)據(jù)分析：使用E&S-胚胎染色體異倍性分析系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。E&S系統(tǒng)以正常樣本為標(biāo)準(zhǔn)判定染色體拷貝數(shù)，在>4 Mb染色體區(qū)域范圍內(nèi)，高于標(biāo)準(zhǔn)1.25倍，則認(rèn)為該區(qū)域重復(fù)，低于標(biāo)準(zhǔn)0.75倍，則認(rèn)為該區(qū)域缺失[6]。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、羅氏易位和相互易位攜帶者PGD結(jié)果

本研究共對來自易位攜帶者91個PGD周期的408個囊胚進行了分析，平均每個囊胚活檢了5～6個外滋養(yǎng)層細(xì)胞進行全基因組擴增再進行NGS檢測。結(jié)果顯示，34.1%(139/408)的胚胎存在其它染色體的異常，其中既有易位相關(guān)又有新發(fā)染色體異常囊胚(圖1)，比例為11.5%(47/408)，而完全新發(fā)染色體異常的囊胚(圖2)比例為22.5%(92/408)。

羅氏易位和相互易位各自的數(shù)據(jù)顯示，羅氏易位攜帶者相關(guān)/新發(fā)染色體異常率為2.4%(3/126)，而相互易位攜帶者的相關(guān)/新發(fā)染色體異常率為15.6%(44/282)，兩者有顯著性差異(P<0.05)。羅氏易位攜帶者的完全新發(fā)染色體異常率為31.7%(40/126)，高于相互易位攜帶者的18.4%(52/282)，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

紅色箭頭分別提示1號染色體三體、8號染色體單體、15號染色體單體圖1 相互易位攜帶者46，XX，t(1；8)(p34.3；q24.3)的既有易位相關(guān)又有新發(fā)染色體異常囊胚的NGS結(jié)果

紅色箭頭提示6號染色體單體圖2 相互易位攜帶者46，XY，t(4；13)(p14；q12)的完全新發(fā)染色體異常的囊胚的NGS結(jié)果

組 別PGD周期數(shù)檢測胚胎數(shù)正?；蛞孜粩y帶胚胎數(shù)相關(guān)染色體異常胚胎數(shù)相關(guān)/新發(fā)染色體異常胚胎數(shù)完全新發(fā)染色體異常胚胎數(shù)羅氏易位2712661(48.4)22(17.5)3(2.4)40(31.7)相互易位6428271(25.2)115(40.8)44(15.6)?52(18.4)合計 91408132(32.4)137(33.6)47(11.5)92(22.5)

注：與羅氏易位組比較，*P<0.05

二、易位攜帶者胚胎新發(fā)染色體異常在不同染色體上的表現(xiàn)

羅氏易位攜帶者胚胎新發(fā)染色體異常涉及除13、14、15和21以外的染色體，而相互易位的新發(fā)染色體異常涉及除14以外的染色體。羅氏易位攜帶者新發(fā)染色體異常主要集中于16和22號染色體非整倍體和8號染色體的結(jié)構(gòu)異常。相互易位攜帶者新發(fā)染色體異常多見于22、15、21、13、16、18號染色體非整倍體和9、11號染色體結(jié)構(gòu)異常(圖3)。

三、新發(fā)染色體異常對PGD臨床結(jié)局的影響

羅氏易位和相互易位攜帶者分別有70.4%(19/27)和54.7%(35/64)的PGD周期檢出完全新發(fā)染色體異常的囊胚。臨床結(jié)局顯示分別有7.4%(2/27)的羅氏易位和18.8%(12/64)的相互易位PGD周期由于新發(fā)染色體異常導(dǎo)致無正常結(jié)果的胚胎可供移植(表4)。

A：羅氏易位和相互易位攜帶者新發(fā)染色體異常在不同染色體上的表現(xiàn)；B：相互易位攜帶者新發(fā)染色體異常之不同染色體數(shù)目異常；C：相互易位攜帶者新發(fā)染色體異常之不同染色體結(jié)構(gòu)異常；D：羅氏易位攜帶者新發(fā)染色體異常之不同染色體數(shù)目異常；E：羅氏易位攜帶者新發(fā)染色體異常之不同染色體結(jié)構(gòu)異常 圖3 易位攜帶者胚胎新發(fā)染色體異常

表4 新發(fā)染色體異常對PGD臨床結(jié)局的影響[n(%)]

討 論

ICE是否存在一直有爭議。若干研究顯示ICE存在于相互易位攜帶者[7-8]和羅氏易位攜帶者[9-10]的精子和卵裂期胚胎中。但另外一些報道則認(rèn)為ICE是不存在的[11]，或者認(rèn)為即使有其它染色體異常增加也不能說明是ICE導(dǎo)致的[12]。還有報道認(rèn)為ICE的發(fā)生取決于易位的區(qū)域以及斷裂的位點[13]。我們認(rèn)為ICE的機理盡管暫時還不明確，但胚胎中新發(fā)染色體異常的現(xiàn)象是存在的，可能會一定程度上影響PGD檢測結(jié)果及臨床結(jié)局，因此我們對此異常進行了相關(guān)的統(tǒng)計。

羅氏易位和相互易位攜帶者的囊胚分別顯示存在34.1%和34.0%的新發(fā)染色體異常。其中羅氏易位攜帶者相關(guān)/新發(fā)染色體異常率僅為2.4%(3/126)，顯著低于相互易位攜帶者的15.6%(44/282)；另外羅氏易位攜帶者的完全新發(fā)染色體異常率為31.7%(40/126)，數(shù)值上高于相互易位攜帶者的18.4%(52/282)，但無顯著性差異(P>0.05)?？赡苡捎诹_氏易位和相互易位各自易位相關(guān)染色體的異常分裂方式不同，相互易位的相關(guān)染色體異常率遠(yuǎn)高于羅氏易位，導(dǎo)致兩種不同易位的相關(guān)/新發(fā)染色體異常率和完全新發(fā)染色體異常率存在一定的差別。

本實驗室的PGD數(shù)據(jù)還顯示母體高齡相比低齡面臨正常胚胎率大幅下降的問題(從31.2%下降至16.7%)。但本研究中的新發(fā)染色體異常的發(fā)生卻不受母體年齡的影響，所有年齡段都保持著相似的水平，與Munné等[11]報道的一致。相互易位攜帶者PGD中，無新發(fā)染色體異常的人群平均年齡為28.73歲(24～43歲)，而有新發(fā)染色體異常的人群平均年齡為29.57歲(21～40歲)，無顯著性差異(P>0.05)，其中有3例攜帶者所有胚胎均有新發(fā)染色體異常，其年齡分別為25歲、27歲、29歲，均不是母體高齡。由此可見易位攜帶人群中新發(fā)染色體異?？赡塥毩⒂谀挲g因素。

遺傳不穩(wěn)定在人類早期胚胎中非常普遍[14]，雖然沒有明確證據(jù)證明ICE是如何干擾分離過程的，但它可能進一步提供了遺傳不穩(wěn)定，容易發(fā)生分離錯誤的環(huán)境。一種可能的解釋是易位相關(guān)的染色體分裂時的重組干擾了其它染色體在紡錘體上的有序排列，進一步影響其它染色體的配對和分離[15]。這種影響是否存在特定染色體的針對性，為此我們統(tǒng)計了羅氏易位和相互易位攜帶者新發(fā)染色體異常在不同染色體上的表現(xiàn)：一方面我們發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)染色體均存在異常，羅氏易位新發(fā)染色體異常涉及除13、14、15和21號以外的染色體，而相互易位新發(fā)染色體異常涉及除14號以外的染色體，羅氏易位的13、14、15和21號是由于其作為相關(guān)染色體出現(xiàn)概率較高，而相互易位的14號可能存在染色體特異性；另一方面發(fā)現(xiàn)羅氏易位攜帶者新發(fā)染色體異常主要集中于16和22號染色體非整倍體和8號染色體的結(jié)構(gòu)異常。相互易位攜帶者新發(fā)染色體異常多見于22、15、21、13、16、18號染色體非整倍體和9、11號染色體結(jié)構(gòu)異常。Wang等[16]對流產(chǎn)組織染色體異常的統(tǒng)計顯示不同常染色體異常前六位分別為16、22、21、15、18、13號染色體異常，與相互易位攜帶者新發(fā)染色體異常涉及常染色體基本一致。這些特定的高發(fā)的染色體非整倍體其發(fā)生概率較高可能與其染色體特異性有關(guān)。此外相互易位攜帶者新發(fā)染色體異常中9號染色體的結(jié)構(gòu)異常高發(fā)于q21.11(長臂2區(qū)1帶1亞帶1次亞帶)，為9號臂間倒位的斷裂熱點區(qū)域，此處可能也是容易受到ICE干擾的區(qū)域，而8號和11號染色體的結(jié)構(gòu)異常均未發(fā)現(xiàn)熱點區(qū)域。此外，在新發(fā)染色體異常中有18例為嵌合結(jié)果，無特定染色體針對性，可能代表了一種在不穩(wěn)定環(huán)境下自我修復(fù)的過程。

我們對存在完全新發(fā)染色體異常囊胚的周期發(fā)生率的數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，最常見的羅氏易位der(13；14)攜帶者為85.7%(12/14)，der(14；21)攜帶者為71.4%(5/7)，而相互易位攜帶者為54.7%(35/64)，其中近端著絲粒染色體易位攜帶者為61.9%(13/21)，染色體末端斷裂(易位的片段占染色體臂的比例<0.2)易位攜帶者為57.1%(16/28)。羅氏易位存在完全新發(fā)染色體異常囊胚的周期發(fā)生率在數(shù)值上要高于相互易位，可能原因是近端著絲粒染色體(D組和G組，羅氏易位相關(guān))的短臂由核糖體RNA串聯(lián)拷貝組成，在間期定位在核仁，當(dāng)形成羅氏易位染色體后，短臂消失，導(dǎo)致其間期無法與核仁結(jié)合，核仁結(jié)構(gòu)的改變可能會影響其它染色體，因為大多數(shù)染色體都有和核仁相互作用的特定序列[17]。

我們進一步分析新發(fā)染色體異常對妊娠結(jié)局的影響。數(shù)據(jù)顯示羅氏易位和相互易位攜帶者分別有70.4%(19/27)和54.7%(35/64)的PGD周期檢出完全新發(fā)染色體異常的囊胚。其臨床結(jié)局為7.4%(2/27)的羅氏易位PGD周期和18.8%(12/64)的相互易位PGD周期，由于新發(fā)染色體異常導(dǎo)致無正常結(jié)果的胚胎可供移植。由此可見，羅氏易位和相互易位攜帶者的囊胚PGD均不同程度的面臨新發(fā)染色體異常的影響。相比于相互易位，羅氏易位囊胚的完全新發(fā)染色體異常的囊胚檢出率更高，但由于羅氏易位可用的正?；蛞孜粩y帶胚胎率更高，實際其PGD周期受影響要小于相互易位。

總之，ICE還存在爭議，由于實驗對象數(shù)量有限以及無法設(shè)置常規(guī)人群對照(即使PGS人群選擇的也都是來尋求輔助生殖的患者，可能本身也存在其它導(dǎo)致染色體異常的影響因素)，我們的統(tǒng)計結(jié)果還無法給這一爭議提供明確的答案，但易位攜帶者胚胎中新發(fā)染色體異常還是必須要面對的問題，其可能獨立于年齡因素，會一定程度上影響PGD檢測結(jié)果及臨床結(jié)局。由于新發(fā)染色體異常的存在，針對易位攜帶者的PGD有必要采用全基因組檢測方法(如芯片和二代測序)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的只能檢測有限染色體的熒光原位雜交方法。