權(quán)金盼 李玉妹 龍宏艷

摘要：采用地衣芽胞桿菌NJU-1411-1和鏈霉菌B221，通過固體發(fā)酵降解羊毛角蛋白，研究培養(yǎng)基含水量、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵周期等發(fā)酵條件的優(yōu)化。結(jié)果表明，2株菌的最佳固體發(fā)酵工藝條件相同，培養(yǎng)基起始含水量為15 mL/10 g羊毛粉，培養(yǎng)基最佳起始pH值為8～9，最適發(fā)酵溫度為40 ℃，發(fā)酵周期為5 d。工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量、體外消化率、動物消化率等方面研究結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量為52.34%;發(fā)酵后體外消化率由67.44%提高至82.20%;動物體內(nèi)消化率達(dá)到85.43%。這些結(jié)果表明發(fā)酵角蛋白產(chǎn)品作為飼料蛋白添加劑完全可行，可用于替代或部分替代魚粉、豆粕等蛋白飼料原料。

關(guān)鍵詞：羊毛角蛋白;微生物降解;固體發(fā)酵;工藝優(yōu)化;工業(yè)化產(chǎn)品;動物消化率

中圖分類號： S182;X172 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0153-04

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，大規(guī)模的畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)生了大量廢棄物，其中包括動物的毛發(fā)、蹄、羽毛等。這些廢棄物富含角蛋白，粗蛋白含量高達(dá)80%以上，含有豐富的蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、胱氨酸等氨基酸，還含有常量元素、微量元素及未知生長因子[1]。角蛋白中所含的胱氨酸更是天然蛋白飼料之冠，可以滿足一部分動物對胱氨酸的需要，是一種良好的、可替代或部分替代魚粉的飼料蛋白來源，對它的開發(fā)利用具有重要應(yīng)用前景：一方面可以解決當(dāng)前飼料工業(yè)中蛋白資源不足;另一方面又可解決環(huán)境污染問題。

對角蛋白資源的開發(fā)利用歷來為人們所關(guān)注。傳統(tǒng)方法主要是利用物理和化學(xué)方法將其降解，目前在國內(nèi)最常用的技術(shù)有高溫水解法和膨化法，而國外則主要采用高溫水解法。但這些方法存在能耗高、環(huán)境污染嚴(yán)重、經(jīng)濟效益不高等問題，同時對氨基酸組成改善也很有限，Wang等認(rèn)為，水解處理可在一定程度上提高羽毛粉的消化率，但也使一部分必需氨基酸如賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸丟失，并引發(fā)一些非營養(yǎng)價值氨基酸的形成[2-3]。由于傳統(tǒng)方法存在許多不足，利用生物技術(shù)途徑來解決羽毛角蛋白的分解利用越來越受到關(guān)注。其主要優(yōu)點有：（1）微生物和角蛋白酶可作用于角蛋白改變其結(jié)構(gòu)，從而降低它對動物消化酶的抗性。（2）處理過程中產(chǎn)生的菌體蛋白可以加強角蛋白產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。用微生物處理過的角蛋白產(chǎn)品中賴氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量比未處理要高，這說明不僅角蛋白可以作為蛋白來源，微生物菌體也可有同樣的效果。（3）對環(huán)境友好，有利于在無污染條件下發(fā)展畜牧業(yè)。

筆者所在實驗室長期致力于羽毛角蛋白的生物技術(shù)利用途徑研究，取得了相關(guān)研究進(jìn)展[4-6];同時在與企業(yè)合作過程中，發(fā)現(xiàn)羊毛廢棄物的生物技術(shù)利用途徑開發(fā)值得關(guān)注。本研究以羊毛廢棄物為原料，開展了角蛋白降解菌固體發(fā)酵羊毛廢棄物的工藝優(yōu)化，并與江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院合作，對獲得的工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行了氨基酸含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、體外消化率、動物消化率等方面的性質(zhì)研究，旨在為利用生物技術(shù)方法開發(fā)利用羊毛廢棄物角蛋白資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鏈霉菌B221、地衣芽孢桿菌NJU-1411-1，均從畜禽場長年堆積角蛋白廢棄物的土壤中經(jīng)過富集培養(yǎng)和分離篩選獲得。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BM）：按文獻(xiàn)[6]所述方法配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基：不同體積的基本培養(yǎng)基中，加入10 g羊毛粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊毛角蛋白的固體發(fā)酵工藝流程

1.2.2 羊毛角蛋白固體發(fā)酵主要參數(shù) （1）培養(yǎng)基起始含水量：10 g羊毛粉中加入BM體積分別為9、12、15、18 mL，固定發(fā)酵溫度為40 ℃，培養(yǎng)基起始pH值為9.0。（2）發(fā)酵溫度：發(fā)酵溫度分別為20、30、40、50 ℃，固定10 g羊毛中加入BM體積為15 mL，培養(yǎng)基起始pH值為9.0。（3）培養(yǎng)基起始pH值：培養(yǎng)基起始pH值分別為6、7、8、9和10，固定發(fā)酵溫度為40 ℃，10 g羊毛中加入BM體積為15 mL。（4）發(fā)酵周期：在上述發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化條件下進(jìn)行固體發(fā)酵，每隔24 h取樣1次，測定角蛋白酶活性、可溶性蛋白質(zhì)含量和水溶性物質(zhì)含量。

工業(yè)化產(chǎn)品在山東合作廠家采用自制的4 t固體發(fā)酵罐完成，共獲得發(fā)酵產(chǎn)品30 t。

1.3 測定方法

1.3.1 角蛋白酶活性、可溶性蛋白質(zhì)含量和水溶性物質(zhì)含量 按文獻(xiàn)[6]所述方法進(jìn)行測定。

1.3.2 工業(yè)化產(chǎn)品分析

1.3.2.1 氨基酸含量測定 將發(fā)酵羊毛粉用鹽酸處理得到氨基酸水解液，然后用高效液相色譜檢測。

1.3.2.2 體外消化率的測定 參照文獻(xiàn)[7]所述方法進(jìn)行。

1.3.2.3 動物消化率的測定 （1）試驗設(shè)計。選取90 kg左右健康蘇鐘豬公豬6頭，分2次試驗，第1次試驗飼喂1號日糧，預(yù)飼期6 d，試驗期4 d;第2次試驗飼喂2號日糧，預(yù)飼期6 d，試驗期4 d。豬只個體單籠飼養(yǎng)，每日早8：00、晚16：00時加料，進(jìn)行定量飼喂，試驗結(jié)束統(tǒng)計每頭豬采食量。（2）試驗日糧。1號日糧：參照NRC（1998）豬營養(yǎng)需要配制，豆粕含量為18%。2號日糧：采用發(fā)酵產(chǎn)品替換1號日糧中的豆粕、豆油等組分，添加量約為20%。（3）糞尿樣收集。全天 24 h 及時全量收集糞、尿，記錄糞質(zhì)量及尿液體積，并進(jìn)行烘干處理。每天收集的鮮糞按四分法縮減至約500 g，加入濃度為10%的硫酸溶液50 mL，于65 ℃下烘干48 h，取出裝入自封袋保存?zhèn)溆?。尿樣用量筒稱量并記錄每頭豬每天的全部產(chǎn)尿量。按原尿體積的10%取樣，并按尿樣體積的5%加入10%濃硫酸固氮，最后將5 d的尿液混勻備用。試驗結(jié)束后稱樣品總質(zhì)量，將所收集的每頭豬風(fēng)干糞樣粉碎均勻混合，按四分法縮減至約100 g，粉碎，全部通過1 mm尼龍篩，裝入樣品瓶中，備用。將每頭供試豬收集的尿樣分別置于玻璃容器中，混合均勻后取其中200 mL樣品備用。（4）蛋白質(zhì)的表觀消化率的測定。用凱氏定氮法測定飼料和糞、尿中粗蛋白的含量，具體方法參考文獻(xiàn)[8]。按下式計算蛋白質(zhì)表觀消化率：

蛋白質(zhì)表觀消化率=（食入料質(zhì)量×料中蛋白質(zhì)含量-糞質(zhì)量×糞中蛋白質(zhì)含量）/食入料質(zhì)量×料中蛋白質(zhì)含量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊毛固體發(fā)酵過程中產(chǎn)物形態(tài)變化

對羊毛的微生物降解產(chǎn)物進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，羊毛形態(tài)變化明顯，如圖1所示。未接菌種的CK組幾乎沒有變化（圖1-C），而接菌的羊毛發(fā)酵物顏色發(fā)黑，體積減少，有明顯的液化現(xiàn)象（圖1-A、圖1-B）。

2.2 主要發(fā)酵參數(shù)對羊毛固體發(fā)酵過程的影響

2.2.1 培養(yǎng)基起始含水量對固體發(fā)酵的影響 固體發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基含水量是非常重要的參數(shù)，是決定固體發(fā)酵能否成功的關(guān)鍵因素之一[9]。水活度與物料的含水量密切相關(guān)，對于微生物而言，過高的含水量會降低溶氧，從而抑制生長;過低的含水量則不能滿足生長的需求。在固體發(fā)酵過程中，包被在固體基質(zhì)表面的水膜溶解了微生物需要的無機鹽和代謝產(chǎn)物，同時為微生物的生長提供了所需的潮濕環(huán)境。另外，基質(zhì)含水量還影響著培養(yǎng)系統(tǒng)中的氧氣供應(yīng)、氣體流動等，是關(guān)系到發(fā)酵成敗的主要制約因素。從圖2可以看出，對于B221和NJU-1411-1，當(dāng)培養(yǎng)基起始含水量為15 mL/10 g羊毛粉時，角蛋白酶酶活性、固體發(fā)酵產(chǎn)物水溶性物質(zhì)含量和可溶性蛋白質(zhì)含量最高。當(dāng)加入的BM培養(yǎng)液為9 mL或 18 mL 時，酶活性、水溶性物質(zhì)含量和可溶性蛋白質(zhì)含量較低，可能是因為含水量過低時，生物熱及通風(fēng)造成水分損失，微生物生長受到限制，直接影響終產(chǎn)物的產(chǎn)量;當(dāng)培養(yǎng)基含水量過高時，培養(yǎng)基有效孔隙變少，使得氧氣供應(yīng)不足。因而培養(yǎng)基含水量過高或過低均不利于固體發(fā)酵的順利進(jìn)行。目前尚無理想的理論模型來預(yù)測固體發(fā)酵的最佳含水量，必須通過試驗來確定。

2.2.2 培養(yǎng)基起始pH值對固體發(fā)酵的影響 pH值也是影響微生物生長代謝的重要因素之一，但由于固態(tài)物料的含水量偏低，常見液態(tài)發(fā)酵中的pH值檢測手段難以應(yīng)用，所以固體發(fā)酵時通常把初始pH值調(diào)到所需要的數(shù)值，發(fā)酵過程一般不再檢測和控制。從圖3可以看出，當(dāng)pH值為9時，B221和NJU-1411-1的角蛋白酶活達(dá)到最大;pH值為8時，發(fā)酵物中可溶性蛋白質(zhì)含量和水溶性物質(zhì)含量為最大，但與pH值為9時差異不大。在相同pH值條件下，NJU-1411-1的發(fā)酵物可溶性蛋白質(zhì)含量比B221的高，pH值為8時NJU-1411-1的發(fā)酵物可溶性蛋白質(zhì)含量為39.17%，B221則為28.77%;所以若從提高產(chǎn)物可溶性蛋白質(zhì)含量的角度出發(fā)，NJU-1411-1更適合于羊毛角蛋白的固體發(fā)酵生產(chǎn)。

2.2.3 發(fā)酵溫度對固體發(fā)酵的影響 溫度是影響微生物生長的重要因素，溫度會影響酶的活性，促進(jìn)或抑制一些特殊代謝產(chǎn)物的生成，溫度過高甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而直接關(guān)系到發(fā)酵過程的正常進(jìn)行以及最終產(chǎn)品的生成。由圖4可以看出，當(dāng)溫度為20 ℃時，角蛋白酶活、發(fā)酵產(chǎn)物中水溶性物質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)含量均較低，微生物對角蛋白的降解也很微弱;隨著溫度的升高，水溶性物質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)含量迅速增加，溫度為40 ℃達(dá)到最高，這說明B221和NJU-1411-1產(chǎn)生的角蛋白酶耐熱，最適發(fā)酵溫度為40 ℃。從溫度實驗結(jié)果分析，B221和NJU-1411-1都具有一定的耐熱性，這為以后進(jìn)一步進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)和實際應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

2.2.3 發(fā)酵周期的確定 根據(jù)上述固體發(fā)酵參數(shù)的研究結(jié)

果，對于B221和NJU-1411-1，均在250 mL三角瓶加入羊毛粉10 g、 BM培養(yǎng)基15 mL， 在培養(yǎng)基初始pH值為8、 培養(yǎng)溫度為40 ℃培養(yǎng)的發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵周期研究。研究結(jié)果表明，發(fā)酵3 d時角蛋白酶活性達(dá)到最大值，NJU-1411-1為24.67 U/mL，B221為7.61 U/mL;隨著發(fā)酵時間延長，角蛋白酶活性逐步降低，可能是因為3 d以后微生物的生長進(jìn)入衰落期，角蛋白酶的分泌減少;發(fā)酵前5 d，水溶性物質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)含量都在不斷提高，但5 d之后趨于平緩，B221從第5天到第6天可溶性蛋白質(zhì)含量只提高了2.07%，而NJU-1411-1甚至有所降低。因此從提高可溶性蛋白質(zhì)含量的目的出發(fā)，確定發(fā)酵周期為5 d。

2.3 工業(yè)化產(chǎn)品的可行性分析

根據(jù)以上發(fā)酵參數(shù)，在山東稍門骨粉廠，于2014年6—9月完成了產(chǎn)品發(fā)酵，并對獲得的產(chǎn)品開展了產(chǎn)品性質(zhì)分析，進(jìn)一步證明了發(fā)酵產(chǎn)品具有良好的替代或半替代魚粉等蛋白資源的可能性。

2.3.1 發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸組成 發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量為52.34%，較原料有所下降，這可能是因為在發(fā)酵過程中，角蛋白大分子不僅被降解為小肽或氨基酸，還可進(jìn)一步分解為氨氣或其他含氮氣體并揮發(fā)掉，實際生產(chǎn)過程中也在發(fā)酵罐里可以聞到很重的氨味，所以羽毛粉的氨基酸總量會減少。從氨基酸組成來看，兩者沒有明顯差異。

2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)品的體外消化率 經(jīng)過發(fā)酵后體外消化率由67.44%提高至82.20%，這可能是因為通過發(fā)酵，角蛋白大分子被降解成為了一些小肽和氨基酸分子，提高了可溶性蛋白質(zhì)含量，從而有助于角蛋白的消化。張洋采用地衣芽孢桿菌FBK-1進(jìn)行角蛋白液體發(fā)酵產(chǎn)生角蛋白酶粗酶液，并研究了粗酶液的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)羽毛粉加入角蛋白酶粗酶液，并在 121 ℃ 處理1 h后羽毛粉的胃酶消化率為78%，消化率提高不是很明顯[11];李寶林等通過對羽毛粉高溫高壓水解法與酶解法的研究，表明高溫高壓水解法體外消化率為32.92%，酶解法體外消化率為66.33%;然后用肉仔雞對酶解羽毛粉氨基酸表觀消化率進(jìn)行測定，結(jié)果為77.02%[12]。本試驗采用微生物固體發(fā)酵，產(chǎn)品的體外消化率有了較大提高?？梢酝茰y，在利用角蛋白資源方面，微生物發(fā)酵方法與純粹的角蛋白酶降解法相比，不僅節(jié)約成本，而且產(chǎn)品的性質(zhì)也可以有更好的改善和提高。

2.3.3 發(fā)酵產(chǎn)品的動物消化率 試驗結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)品的動物體內(nèi)消化率為85.43%。李曉燕等研究了酶解羽毛粉替代日糧魚粉對生長豬蛋白質(zhì)消化率的影響，對照組采用3%進(jìn)口魚粉添加日糧，處理Ⅰ、處理Ⅱ分別用酶解羽毛粉按50%、100%蛋白比例替代對照組日糧中含等量蛋白質(zhì)的魚粉，結(jié)果表明對照組蛋白消化率為76.50%，處理Ⅰ和處理Ⅱ分別為75.83%和74.68%，處理Ⅰ和處理Ⅱ蛋白質(zhì)消化率與對照組相比均下降，但各組間差異不顯著[13]。在本試驗中，豬日糧的發(fā)酵羽毛粉添加量較大（為飼料總量的20%），雖然對飼料適口性有一定影響，但在豬體內(nèi)的蛋白消化率依然能保持在較高水平，達(dá)到85.43%，這為產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。3 結(jié)論

對于地衣芽胞桿菌NJU-1411-1和鏈霉菌B221，羊毛角蛋白最佳固體發(fā)酵工藝條件基本相同，培養(yǎng)基起始含水量為15 mL/10 g羊毛粉;培養(yǎng)基最佳起始pH值為8 ～ 9;最適發(fā)酵溫度為40 ℃;發(fā)酵周期為5 d。

本研究檢測了發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量、體外消化率和動物體內(nèi)消化率。結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量為52.34%;發(fā)酵后體外消化率由67.44%提高至82.20%;在動物體內(nèi)具有良好的消化率，達(dá)到85.43%。發(fā)酵角蛋白產(chǎn)品作為飼料蛋白添加劑完全可行，可用于替代或部分替代魚粉、豆粕等一些價格較高的蛋白飼料原料。

參考文獻(xiàn)：

[1]Marshall R C，Orwin D F，Gillespie J M. Structure and biochemistry of mammalian hard keratin[J]. Electron Microscopy Reviews，1991，4（1）：47-83.

[2]Wang X，Parsons C M. Effect of processing systems on protein quality of feather meals and hog hair meals[J]. Poultry Science，1997，76（3）：491-496.

[3]Latshaw J D，Musharaf N，Retrum R. Processing of feather meal to maximize its nutritional value for poultry[J]. Animal Feed Science and Technology，1994，47（3/4）：179-188.

[4]朱曉飛，張 玲，趙平芝，等. 鏈霉菌B221的角蛋白降解機制初探[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（6）：18-22.

[5]聶慶霽，史玉峰，王 玲，等. 地衣芽孢桿菌nju-1411-1降解羽毛角蛋白過程中含硫化合物的變化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（4）：258-261.

[6]羅 蕾，史玉峰，崔丹丹，等. 4種含硫化合物對鏈霉菌B221固體發(fā)酵羽毛角蛋白過程的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（2）：310-313.

[7]Boisen S，F(xiàn)ernandez J A. Prediction of the apparent ileal digestibility of protein and amino acids in feedstuffs and feed mixtures for pigs by in vitro analyses[J]. Animal Feed Science and Technology，1995，51（1）：29-43.

[8]譙仕彥，李德發(fā)，楊 勝.不同加工處理的大豆蛋白日糧對仔豬斷奶后腹瀉影響的研究[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報，1995，7（4）：1-6.

[9]董榮斌，張 玲，朱曉飛，等. 耐熱鏈霉菌B221降解羽毛角蛋白的固體發(fā)酵條件研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（6）：249-251，267.

[10]Pandy A，Socool C R，Mitchell D. New developments in solid state fermentation：Ⅰ. Bioprocesses and products[J]. Process Biochemistry，2000，35（10）：1153-1169.

[11]張 洋. 一種新型角蛋白酶的發(fā)酵、理化性質(zhì)及應(yīng)用研究[D]. 福州：福州大學(xué)，2005：35-49.

[12]李寶林，張維金，崔德成. 酶解羽毛粉加工方法的研究及在飼料中的使用[C]//中國家禽科學(xué)研究進(jìn)展——第十四屆全國家禽科學(xué)學(xué)術(shù)討論會論文集. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2009：790-794.

[13]李曉燕，喻 洋，肖英平，等. 酶解羽毛粉的體外蛋白質(zhì)消化率及其在生長豬日糧中的應(yīng)用效果[J]. 中國畜牧雜志，2012，48（15）：33-36.