龐寧寧 樊懷福 王哲

摘要：韌皮部蛋白2（PP2）是植物特異性的韌皮部蛋白，通過參與植物調(diào)控其細胞內(nèi)基因表達水平和產(chǎn)物活性來應對自然界中的各種脅迫，對于維持植物株體形態(tài)、體內(nèi)物質(zhì)運轉(zhuǎn)和保護愈合植物傷口有重要意義。以前期克隆得到的黃瓜（Cucumis sativus）PP2-A1蛋白序列為對象，利用生物信息學方法，對黃瓜PP2-A1蛋白序列進行生物學功能分析。結(jié)果表明，黃瓜PP2-A1蛋白具有親水性，比較不穩(wěn)定，半衰期短，無信號肽段，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，是定位在胞質(zhì)的非分泌蛋白;結(jié)合對其二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預測分析，得出PP2-A1是以無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主的片層結(jié)構(gòu);構(gòu)建PP2的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)其與香瓜親緣關(guān)系最近，同時預測其結(jié)構(gòu)功能域，發(fā)現(xiàn)其具有1個典型的PP2結(jié)構(gòu)功能域。

關(guān)鍵詞：黃瓜;PP2-A1蛋白;分子生物信息學;親水性;系統(tǒng)發(fā)育樹

中圖分類號： S642.201 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0046-03

韌皮部蛋白（phloem protein，PP）是從植物韌皮部汁液中提取出來的能特異性結(jié)合幾丁質(zhì)的一種凝集素[1-2]，植物韌皮部蛋白是通過調(diào)控植物細胞內(nèi)基因表達水平和產(chǎn)物活性來應對自然界中的各種脅迫參與到植物生命活動中，對于維持植物株體形態(tài)、內(nèi)體物質(zhì)的運轉(zhuǎn)和愈合植物傷口有著重要意義[3]。韌皮部蛋白2（PP2）是韌皮部汁液中最豐富、最神秘的蛋白質(zhì)之一，韌皮部蛋白基因2在植物界的廣泛分布也表明它們在維管植物中是古老的、常見的[4]，它是一種二聚體幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素，能夠在同化物流中起轉(zhuǎn)運的作用，并且其中的凝集素活性或RNA結(jié)合特性可以在長距離上發(fā)揮功能[5-6]。由于篩管不能轉(zhuǎn)錄和翻譯，韌皮部蛋白質(zhì)最可能在緊密連接的伴侶細胞中合成，并通過胞間連絲轉(zhuǎn)運到篩分元件中[7]。韌皮部液體的特異性蛋白質(zhì)組成表明，這些蛋白質(zhì)不僅對篩管維持，而且對于整個植物的生理和發(fā)育也起了重要的作用[8]。任何不同植物物種的蛋白質(zhì)都可從成熟篩管的汁液中分離出來，但是迄今為止，僅有少數(shù)已確定其功能特征[9]。

Lee等使用FPLC凝膠過濾柱從熱處理的擬南芥幼苗的蛋白質(zhì)提取物中提取了幾種韌皮部汁液蛋白，發(fā)現(xiàn)它們從功能上表征了PP2-A1基因，其編碼氨基酸也類似于韌皮部凝集素的蛋白質(zhì)，利用細菌表達的AtPP2-A1重組蛋白，發(fā)現(xiàn)其具有雙重功能，即分子伴侶活性和抗真菌活性。在擬南芥防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，能夠?qū)垢鞣N外部脅迫，包括真菌病原侵襲和熱休克[10]。前期通過iTRAQ蛋白組學的方法研究了鹽脅迫對于黃瓜韌皮部滲出液蛋白質(zhì)組的影響，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，黃瓜PP2-A1蛋白的表達量顯著上調(diào)，推測這可能是黃瓜韌皮部適應逆境脅迫的一種響應機制[11]。本研究通過分子生物信息學的方法，研究黃瓜PP2-A1蛋白序列的進化情況，并對黃瓜PP2-A1蛋白的理化特性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、亞細胞定位情況和二、三級結(jié)構(gòu)等進行分析，旨在了解黃瓜PP2-A1蛋白的基本特性，并預測它的功能，為進一步揭示PP2-A1基因的防御功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以前期克隆得到的黃瓜（Cucumis sativus）PP2-A1蛋白序列為對象，利用生物信息學方法，對黃瓜PP2-A1蛋白序列進行生物學功能分析。

1.2 方法

1.2.1 理化性質(zhì)分析及疏水性結(jié)構(gòu)預測 應用ExPAsY Protparam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）在線分析工具對黃瓜PP2-A1蛋白分子量（MW）、等電點（pI）等進行預測分析;利用在線軟件ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）預測黃瓜PP2-A1蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)。

1.2.2 亞細胞定位、信號肽以及跨膜結(jié)構(gòu)預測 利用Signal IP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/performance.php）對黃瓜PP2-A1蛋白N-末端信號肽進行預測分析，利用SubLoc V1.0（https：//omictools.com/subloc-tool）對PP2-A1蛋白分析亞細胞定位情況;利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.biomedsearch.com/sci/TMHMM-server-v.html）預測PP2-A1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.3 糖基化位點預測及磷酸化位點預測 應用NetNGlyc1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和NetOGly4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）在線軟件分別對黃瓜PP2-A1蛋白的N-糖基化位點和O-糖基化位點進行分析預測。利用Net Phos 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/）預測其磷酸化位點。

1.2.4 二、三級結(jié)構(gòu)預測 利用ExPAsY SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）軟件對該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預測;使用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/）軟件同源建模法預測目的蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.2.5 系統(tǒng)進化樹 構(gòu)建在線搜索美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫的BlastP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具，提交黃瓜PP2-A1蛋白序列，BLAST分析目的蛋白同源性序列，找出與黃瓜PP2-A1蛋白同源性高的蛋白序列，應用ClustalX程序?qū)Φ鞍仔蛄羞M行多序列比對，采用系統(tǒng)發(fā)育分子進化分析軟件MEGA（Ver.5.0），基于Neighbor-Joining distance（鄰近距離法）算法，利用Poisson correct modetionl構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[12]，研究黃瓜PP2-A1蛋白序列發(fā)育情況。

1.2.6 結(jié)構(gòu)域及功能位點預測 應用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/help/smart_glossary.shtml）在線提交PP2-A1蛋白的氨基酸序列，對其蛋白結(jié)構(gòu)功能域的功能位點進行預測。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜PP2-A1蛋白的理化性質(zhì)分析及疏水性結(jié)構(gòu)預測

用ProtParam預測分析黃瓜PP2-A1蛋白的理化性質(zhì)，分析結(jié)果顯示，黃瓜PP2-A1蛋白含154個氨基酸，預測分子量為17 540.9 u，理論等電點（pI）為7.76，正電荷殘基數(shù)為13個，負電荷殘基數(shù)為12個，總共包含2 419個原子，分子式為 C787H1 183N223O218S8，黃瓜PP2-A1蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為46.78（>45為不穩(wěn)定），堿性氨基酸賴氨酸含量較高，此蛋白呈弱堿性。蛋白的總平均親水性為-0.184，說明蛋白為不穩(wěn)定弱堿性親水蛋白。用在線軟件ProtScale預測分析PP2-A1蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果見圖1，親水性/疏水性最小值為-2.456，最大值為1.344，總體表現(xiàn)為親水性。這與之前的分析相互驗證。

2.2 黃瓜PP2-A1蛋白的亞細胞定位、信號肽以及跨膜結(jié)構(gòu)分析

典型的跨膜螺旋區(qū)主要是由20～30個疏水性氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸等）組成;親水殘基往往出現(xiàn)在疏水殘基之間，對蛋白質(zhì)功能有重要的作用。用在線軟件TMHMM Server v. 2.0基于HMM方法的蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預測工具，分析黃瓜韌皮部基因編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該基因編碼的蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，不可能是膜上的受體或定位于膜上。用在線軟件SignalP4.0分析黃瓜凝集素PP2-A1蛋白，最后的計算結(jié)果為“NO”，表明該基因編碼的蛋白無信號肽。通過在線軟件SubLocV1.0對蛋白質(zhì)亞細胞進行定位，分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能存在于細胞周質(zhì)中。

2.3 黃瓜PP2-A1蛋白的糖基化位點預測及磷酸化位點預測

N-糖基化是指糖鏈通過N-乙酰葡萄糖胺連接到蛋白質(zhì)上保守序列N-X-S/T中的天冬酰胺的氨基側(cè)鏈上[13]，結(jié)果如圖2所示，利用NetNGlyc軟件對其N-糖基化位點分析可知，黃瓜PP2-A1蛋白可能有2個N-糖基化位點，分別為第21、第77位的天冬酰胺殘基，因此黃瓜PP2-A1蛋白應該具有N-糖基化機制，用NetOGlyc分析軟件對黃瓜PP2-A1蛋白的O-糖基化位點預測，結(jié)果表明黃瓜PP2-A1蛋白沒有潛在的O-連接糖基化位點。對黃瓜PP2-A1蛋白的磷酸化位點分析發(fā)現(xiàn)（圖3），目的蛋白有4個絲氨酸位點、4個蘇氨酸位點、1個酪氨酸位點。

2.4 黃瓜PP2-A1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測分析

PP2-A1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測分析結(jié)果如圖4所示，圖中由短至長的豎線依次為無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈、α螺旋。結(jié)果顯示，該蛋白包含43.51%無規(guī)則卷曲（random coil）、35.70%延伸鏈（extended strand）、13.64α螺旋（alpha helix）、7.14%β轉(zhuǎn)角（beta turn）。因此，黃瓜PP2-A1蛋白的二級結(jié)構(gòu)中多為無規(guī)則卷曲和片層結(jié)構(gòu)。

2.5 黃瓜PP2-A1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測分析

用Phyre2在線軟件預測黃瓜PP2-A1蛋白的三級結(jié)構(gòu)，獲得的黃瓜韌皮部凝集素的3D模型如圖5所示，與二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果一致，該蛋白主要由無規(guī)則卷曲、延伸鏈和α螺旋組成。

2.6 構(gòu)建黃瓜PP2-A1蛋白的系統(tǒng)進化樹

利用NCBI網(wǎng)站Blastp比對黃瓜PP2-A1蛋白的同源序列，下載與PP2-A1蛋白相似性較高的甜瓜（Cucumis melo）、南瓜（Cucurbita moschata）、筍瓜（Cucurbita maxima）等物種的氨基酸序列，使用ClustalX2.1軟件對黃瓜PP2-A1蛋白序列進行多序列對比。運用MEGA5.0軟件構(gòu)建基于PP2家族不同氨基酸序列的進化樹，結(jié)果如圖6所示，可以看出黃瓜

（Cucumis sativus）PP2蛋白與甜瓜PP2蛋白在同一分枝上聚為同一類，相似性為68.18%，說明甜瓜與其親緣性較近;其與另一個分枝上的葫蘆科南瓜屬的日本南瓜（Cucurbita argyrosperma）相似性為27.93%，與筍瓜和金瓜（Cucurbita digitata）的相似性同為27.80%，與南瓜的相似性為25.68%。

2.7 黃瓜PP2-A1蛋白的結(jié)構(gòu)域及功能位點預測

根據(jù)SMART分析結(jié)果顯示，該蛋白具有一個典型的韌皮部蛋白2功能結(jié)構(gòu)域，在該序列的氨基酸位置為12～153;對其編碼蛋白的功能位點進行預測，發(fā)現(xiàn)該序列包含3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、1個N-豆蔻?；稽c、1個蛋白激酶C磷酸化位點、2個N-糖基化位點（表1）。

3 討論與結(jié)論

基于生物信息學的角度，利用分子生物信息學各種相關(guān)軟件的手段，分析黃瓜PP2-A1蛋白序列的生物學特征，發(fā)現(xiàn)該蛋白是由20種氨基酸組成的一種不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，對PP2-A1蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和亞細胞定位分析，發(fā)現(xiàn)其不具備信號肽段，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，并且在膜內(nèi)定位的概率幾乎為0，故該蛋白質(zhì)為非分泌非跨膜的膜外（胞質(zhì)）蛋白質(zhì)。分析其二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白質(zhì)中無規(guī)則卷曲和延伸鏈所占的比重較大，結(jié)合對其三級結(jié)構(gòu)的預測，證實了該蛋白質(zhì)的肽鏈主要以無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主。有研究表明，無規(guī)則卷曲經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和特異性功能部位[14]，而研究表明來自葫蘆科的韌皮部蛋白2是一種表達量很高的韌皮部蛋白，其mRNA高度保守且具有韌皮部組織特異性，并且能在植物體受到侵害時發(fā)生韌皮部防衛(wèi)反應，對于抵抗外界環(huán)境中生物以及非生物脅迫具有重要作用[15]。并且由在線軟件分析得出，黃瓜PP2-A1基因編碼的蛋白含有N-糖基化位點，前人研究也表明，韌皮部蛋白2（PP2）是一種優(yōu)先特異結(jié)合N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體的、大小為49 ku亞基的二聚體蛋白。經(jīng)過對黃瓜PP2-A1蛋白的同源性分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜與甜瓜的親緣關(guān)系比較近，與南瓜屬的日本南瓜、筍瓜等比較接近，這與植物傳統(tǒng)分類表上的分類關(guān)系基本一致。同時分析其結(jié)構(gòu)功能域時發(fā)現(xiàn)，在12～153有1個典型的PP2（韌皮部蛋白2）功能域，表明該基因是PP2基因家族的一個成員。

總之，本研究從生物信息學角度，以黃瓜PP2-A1基因編碼的蛋白為分析對象，對PP2-A1基因推導的氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征進行分析，同時對其整個肽鏈的理化性質(zhì)、疏水性、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和亞細胞定位、糖基化位點、磷酸化位點及其二、三級結(jié)構(gòu)特征等進行預測分析，并構(gòu)建黃瓜韌皮部蛋白親緣關(guān)系的進化樹，同時也對黃瓜PP2-A1蛋白的結(jié)構(gòu)域及功能位點進行預測，為進一步研究蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)及探尋黃瓜PP2-A1基因的潛在功能提供參考。利用分子生物信息學手段，基于已獲得的黃瓜韌皮部蛋白編碼信息，對黃瓜韌皮部蛋白進行結(jié)構(gòu)、特征及親緣關(guān)系分析，可增進對黃瓜韌皮部蛋白的認識，利于從分子水平上解釋和挖掘黃瓜韌皮部蛋白的生物功能，為后續(xù)研究黃瓜PP2-A1基因試驗奠定基礎(chǔ)。

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