齊帆 范興 陳義

摘要：C2H2型鋅指蛋白在植物響應(yīng)逆境脅迫以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用，為了發(fā)掘響應(yīng)干旱脅迫的谷子C2H2型鋅指蛋白基因（SiC2H2），利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)構(gòu)建谷子聚乙二醇（PEG）處理前后轉(zhuǎn)錄組文庫，根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)鑒定出11個(gè)SiC2H2差異表達(dá)基因，對其進(jìn)行理化性質(zhì)、啟動(dòng)子元件等部分生物信息學(xué)分析和進(jìn)化樹及基因結(jié)構(gòu)分析。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）驗(yàn)證結(jié)果表明，隨機(jī)選取的4個(gè)基因在PEG脅迫前后的表達(dá)特點(diǎn)與表達(dá)譜數(shù)據(jù)基本一致。研究結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步研究C2H2型鋅指蛋白在谷子抗旱性中的作用以及谷子抗旱分子育種提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：谷子;C2H2型鋅指蛋白;干旱脅迫;差異表達(dá)基因

中圖分類號(hào)： S515.01 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0041-05

干旱是我國糧食生產(chǎn)的重要制約因素之一，且干旱的頻率和程度日趨嚴(yán)重，因此選育抗旱品種已成為育種的重要目標(biāo)。谷子[Setaria italica （L.） P. Beauv.]屬禾本科狗尾草屬，具有耐旱、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)、水分利用率高等特點(diǎn)，在作物抗旱種質(zhì)資源利用方面具有其獨(dú)特的研究價(jià)值[1]。谷子全基因組測序的完成為研究谷子功能基因組提供了平臺(tái)[2-3]，發(fā)掘與鑒定谷子抗旱基因資源、探索谷子抗旱機(jī)制對于促進(jìn)其基因資源的利用和抗旱育種有著極為重要的理論和實(shí)踐意義。

鋅指蛋白是植物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子中最大的家族之一，具有指狀結(jié)構(gòu)且能結(jié)合鋅離子[4]，其中的C2H2型鋅指蛋白具有一段高度保守的氨基酸特征序列QALGGH，含有由大約30個(gè)氨基酸組成的鋅指結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的保守序列為X2CX2～4CX12HX2～8H[5]。C2H2型鋅指蛋白廣泛參與調(diào)控植物的生長和發(fā)育[6-9]，而且越來越多的研究表明，C2H2型鋅指蛋白在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中起著非常重要的作用，許多與植物脅迫耐受相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白已得到鑒定[10-12]。DNA芯片分析結(jié)果顯示，擬南芥C2H2型鋅指蛋白中Cl-2i類（Zat家族）的一些成員在各種生物和非生物脅迫下上調(diào)表達(dá)，其中2個(gè)被廣泛研究的成員Zat10（STZ）和Zat12，能夠被干旱、鹽、滲透、溫度、傷害、氧化和高光等脅迫所誘導(dǎo);遺傳分析結(jié)果也表明，Zat10和Zat12參與調(diào)節(jié)了活性氧清除基因的表達(dá)進(jìn)而提高了植物對干旱、鹽漬以及氧化脅迫的忍耐力[6]。水稻中C2H2型鋅指蛋白的部分成員，如ZFP245、ZFP252和ZFP179也被證明參與了水稻對干旱、鹽和氧化脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[13]。水稻ZFP182和ZFP36參與了脫落酸（ABA）誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)，在提高植物對水分脅迫以及氧化脅迫的忍耐力方面起到了重要的調(diào)節(jié)作用[14-15]。在煙草中過量表達(dá)矮牽牛C2H2型鋅指蛋白基因ZPT2-3，明顯提高了轉(zhuǎn)基因煙草對干旱脅迫的耐受能力[16]。目前已經(jīng)在許多植物，如擬南芥、水稻、小麥、煙草中分離到近百個(gè)C2H2型鋅指蛋白基因。

谷子作為我國重要的農(nóng)作物之一，近年來已逐漸成為開展C4植物和抗旱耐逆研究的模式植物[17]。目前人們已經(jīng)從谷子中鑒定出124個(gè)SiC2H2，它們大都參與非生物逆境脅迫響應(yīng)[18]，然而具體哪些成員參與了干旱脅迫響應(yīng)過程還不清楚，在這一過程中的具體作用和功能還有待于進(jìn)一步研究。本研究擬通過轉(zhuǎn)錄組測序表達(dá)譜數(shù)據(jù)，從谷子中鑒定響應(yīng)干旱脅迫的C2H2型鋅指蛋白，篩選參與干旱脅迫應(yīng)答的關(guān)鍵SiC2H2基因，以期為闡明C2H2型鋅指蛋白在谷子抗旱性中的作用以及利用分子生物學(xué)手段提高作物的抗旱性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年9月至2017年9月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所、雜糧基因與分子育種山西省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.1 試驗(yàn)材料

以谷子JF16為試驗(yàn)材料，其種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所提供。將谷子在人工氣候室中培養(yǎng)，采用體積比為3 ∶ 1的營養(yǎng)土、蛭石混合土種植，培養(yǎng)3周后，對谷子幼苗進(jìn)行20% PEG-6000（聚乙二醇-6000）溶液模擬干旱脅迫處理，以蒸餾水處理作為對照，處理0.5 h后分別剪取幼苗植株葉片，迅速放于液氮中冷凍，用于轉(zhuǎn)錄組測序;同上，處理0、0.5、1、2、4 h后取材，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。

1.2 SiC2H2差異表達(dá)基因的篩選

基因表達(dá)量用TPM值（transcripts per million，即每百萬條reads的轉(zhuǎn)錄本）表示，運(yùn)用R語言繪制基因的表達(dá)值熱圖。根據(jù)對照組和干旱處理組中基因的TPM值來比較不同處理間的基因差異表達(dá)。本研究中差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，簡稱FDR）≤0.001且差異倍數(shù)（fold change，簡稱FC）在2倍以上，即∣log2（fold change）∣≥1。

1.3 SiC2H2基因生物信息學(xué)分析

從谷子基因組數(shù)據(jù)庫phytozome v 12.0（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中找出所有C2H2型鋅指蛋白基因，并從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中查找到相對應(yīng)的基因，提取其在基因組數(shù)據(jù)庫中的基本信息;利用DNAMAN6.0預(yù)測蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì);用Plant CARE（http：bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析SiC2H2基因啟動(dòng)子（起始密碼子ATG上游1.5 kb的DNA序列）順式作用元件;使用MEGA6.0構(gòu)建SiC2H2氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹;利用GSDS在線工具（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）制作SiC2H2基因結(jié)構(gòu)圖。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析

參照RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaRa）使用說明，從各處理樣品中提取總RNA以及合成cDNA。根據(jù)基因序列信息，采用軟件Primer 5.0進(jìn)行real-time RT-PCR特異性引物設(shè)計(jì)（表1）。使用美國Bio-Rad CFX96TM Touch Real-Time PCR System對基因進(jìn)行相對定量RT-PCR分析。兩步法PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，以β-actin作為內(nèi)參，用2-ΔΔCT的方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，基因在處理 0 h 時(shí)的相對表達(dá)量設(shè)定為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiC2H2差異表達(dá)基因篩選

利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從表達(dá)譜數(shù)據(jù)中共得到44個(gè)SiC2H2基因，將這些基因在正常澆水對照組（control）與PEG模擬干旱處理組（PEG）中的表達(dá)量進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化熱圖分析（圖1），其中18個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，25個(gè)下調(diào)表達(dá)，1個(gè)無差異表達(dá)。

為篩選鑒定響應(yīng)干旱的關(guān)鍵SiC2H2基因，對正常澆水和干旱處理的表達(dá)譜進(jìn)行比較，根據(jù)基因表達(dá)量（TPM值）計(jì)算該基因在同一品種不同處理間的差異表達(dá)倍數(shù)，以FDR≤0.001、∣log2（FC）∣≥1（即倍數(shù)差異在2倍以上）為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共獲得11個(gè)差異表達(dá)基因（圖2），其中編號(hào)為Si017660m、Si022296m、Si023013m、Si003051m、Si037343m、Si037672m的基因在干旱脅迫下與對照相比上調(diào)表達(dá)，而編號(hào)為Si016736m、Si018078m、Si029540m、Si037164m、Si029897m的基因下調(diào)表達(dá)。

2.2 SiC2H2基本信息與理化性質(zhì)

針對獲得的11個(gè)差異表達(dá)基因，對其基本信息與理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，如表2所示，它們分別位于第1、2、3、5、9號(hào)染色體上，基因序列長度處于844～7 484 bp之間，平均長度為2 652 bp;氨基酸序列長度處于184～585個(gè)之間，平均長度為332個(gè)，分子量處于19.4～60.2 ku之間，平均分子量為 352 ku;理論等電點(diǎn)為6.05～ 9.17，平均為7.12。

2.3 SiC2H2進(jìn)化樹及基因結(jié)構(gòu)分析

谷子C2H2型鋅指蛋白家族成員分成5個(gè)亞家族，本研究使用MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining算法對11個(gè)SiC2H2氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)它們分別屬于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ亞家族，基因結(jié)構(gòu)分析顯示，同一亞族的基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.4 SiC2H2基因啟動(dòng)子元件分析

啟動(dòng)子是基因表達(dá)與調(diào)控的“分子開關(guān)”，對啟動(dòng)子順式作用元件的分析將有助于研究該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其生物學(xué)功能。如表3所示，11個(gè)SiC2H2基因啟動(dòng)子區(qū)包含多種激素響應(yīng)順式作用元件，如核心序列為CACGTG的脫落酸應(yīng)答元件ABRE、水楊酸應(yīng)答元件TCA-element、乙烯應(yīng)答元件ERE、赤霉素應(yīng)答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif及生長素應(yīng)答元件TGA-element;同時(shí)包含多種參與植物非生物逆境脅迫響應(yīng)的順式作用元件，如干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS、熱激應(yīng)答元件HSE、參與低溫響應(yīng)的順式作用元件LTR以及參與防御和脅迫響應(yīng)的元件 TC-rich repeats。每個(gè)基因至少含有6個(gè)與激素及脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件，并且所有基因都含有與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的ABRE作用元件或者M(jìn)BS作用元件，表明這些SiC2H2基因極有可能參與調(diào)控谷子生長發(fā)育及脅迫應(yīng)激反應(yīng)，尤其是干旱脅迫響應(yīng)。

2.5 SiC2H2基因熒光定量RT-PCR驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)譜中響應(yīng)干旱的SiC2H2基因表達(dá)特性，以PEG處理0、0.5、1、2、4 h的谷子幼苗為材料，隨機(jī)篩選4個(gè)基因Si037343m、Si023013m、Si022296m、Si037164m，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對它們的基因表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。如圖4所示，4個(gè)基因在PEG干旱脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)趨勢與表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)果基本吻合，說明表達(dá)譜數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)研究。

3 討論與結(jié)論

干旱是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的環(huán)境脅迫因子，為保證全球人口日益增加的糧食供應(yīng)，在干旱條件下最大限度地提高作物產(chǎn)量潛力、保持作物產(chǎn)量穩(wěn)定是十分重要的。植物感知和應(yīng)對干旱脅迫的機(jī)制非常復(fù)雜，在耐旱脅迫反應(yīng)過程中許多干旱響應(yīng)基因被激活，其中植物C2H2型鋅指蛋白作為植物轉(zhuǎn)錄因子大家族之一，廣泛參與了植物生長發(fā)育與逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，許多C2H2型鋅指蛋白介導(dǎo)的干旱脅迫響應(yīng)過程被發(fā)現(xiàn)。最近的研究表明，擬南芥ZAT18在干旱脅迫下相應(yīng)基因表達(dá)量顯著上調(diào)，過表達(dá)植株與對照相比具有更強(qiáng)的耐旱性，ZAT18在干旱脅迫響應(yīng)過程中起到正調(diào)控作用[19]，而大豆中的1個(gè)具有QALGGH保守結(jié)構(gòu)域的C2H2型鋅指蛋白GmZFP3則通過ABA依賴途徑負(fù)調(diào)控植物對干旱脅迫的響應(yīng)[20]。甘薯IbZFP1通過參與調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脯氨酸合成及活性氧清除進(jìn)而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫與干旱脅迫的耐性[21]。

隨著全基因組測序的完成，目前在谷子中發(fā)現(xiàn)124個(gè)C2H2型鋅指蛋白家族成員[18]，本研究通過分析谷子PEG處理葉片轉(zhuǎn)錄組，進(jìn)一步研究了其中11個(gè)響應(yīng)干旱的差異表達(dá)基因，其中6個(gè)在干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)，5個(gè)下調(diào)表達(dá)，并對這11個(gè)應(yīng)答干旱脅迫的SiC2H2基因進(jìn)行了理化性質(zhì)等生物信息學(xué)分析。這些SiC2H2基因啟動(dòng)子序列區(qū)中含有多種與逆境以及激素相關(guān)的順式作用元件，其中大多數(shù)基因都具有脫落酸應(yīng)答元件ABRE、干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS以及茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif，說明它們極有可能通過依賴ABA途徑或者非ABA依賴途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程來調(diào)控植物對干旱脅迫的響應(yīng)。使用熒光定量RT-PCR對4個(gè)隨機(jī)選擇的基因進(jìn)行表達(dá)情況檢測，它們在PEG脅迫下的表達(dá)特性總體趨勢與表達(dá)譜測序結(jié)果基本是吻合的，但在具體表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)以及出現(xiàn)峰值的時(shí)間點(diǎn)上存在差異，這可能與所取材料、數(shù)據(jù)分析方法及檢測靈敏度等不同有關(guān)。

本研究基于PEG干旱脅迫谷子葉片轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，鑒定出44個(gè)SiC2H2基因，并對其中11個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證，研究結(jié)果為從轉(zhuǎn)錄組水平揭示谷子響應(yīng)干旱脅迫的分子調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Diao X M，Schnable J，Bennetzen J L，et al. Initiation of Setaria as a model plant[J]. Frontiers of Agricultural Science and Engineering，2014，1（1）：16-20.

[2]Zhang G，Liu X，Quan Z，et al. Genome sequence of foxtail millet （Setaria italica） provides insights into grass evolution and biofuel potential[J]. Nature Biotechnology，2012，30（6）：549-554.

[3]Bennetzen J L，Schmutz J，Wang H，et al. Reference genome sequence of the model plant Setaria[J]. Nature Biotechnology，2012，30（6）：555-561.

[4]Takatsuji H. Zinc-finger proteins：the classical zinc finger emerges in contemporary plant science[J]. Plant Molecular Biology，1999，39（6）：1073-1078.

[5]Pabo C O，Peisach E，Grant R A. Design and selection of novel Cys2His2 zinc finger proteins[J]. Annual Review of Biochemistry，2001，70（70）：313-340.

[6]Kiebowicz-Matuk A. Involvement of plant C2H2-type zinc finger transcription factors in stress responses[J]. Plant Science，2012，185-186（4）：78-85.

[7]Sakamoto H，Maruyama K，Sakuma Y，et al. Arabidopsis Cys2/his2-type zinc-finger proteins function as transcription repressors under drought，cold，and high-salinity stress conditions[J]. Plant Physiology，2004，136（1）：2734-2746.

[8]Xiao H，Tang J，Li Y，et al. STAMENLESS 1，encoding a single C2H2 zinc finger protein，regulates floral organ identity in rice[J]. Plant Journal，2009，59（5）：789-801.

[9]Wang Y，Dou D，Wang X，et al. The PsCZF1 gene encoding a C2H2 zinc finger protein is required for growth，development and pathogenesis in Phytophthorasojae[J]. Microbial Pathogenesis，2009，47（2）：78-86.

[10]Tian Z D，Zhang Y，Liu J，et al. Novel potato C2H2-type zinc finger protein gene，StZFP1，which responds to biotic and abiotic stress，plays a role in salt tolerance[J]. Plant Biology，2010，12（5）：689-697.

[11]Sun S J，Guo S Q，Yang X，et al. Functional analysis of a novel Cys2/His2-type zinc finger protein involved in salt tolerance in rice[J]. Journal of Experimental Botany，2010，61（10）：2807-2818.

[12]Kodaira K S，Qin F，Lam-Son P T，et al. Arabidopsis Cys2/His2 zinc-finger proteins AZF1 and AZF2 negatively regulate abscisic acid-repressive and auxin-inducible genes under abiotic stress conditions[J]. Plant Physiology，2011，157（2）：742-756.

[13]Huang J，Sun S，Xu D，et al. A TFIIIA-type zinc finger protein confers multiple abiotic stress tolerances in transgenic rice （Oryza sativa L.）[J]. Plant Molecular Biology，2012，80（3）：337-350.

[14]Zhang H，Ni L，Liu Y P，et al. The C2H2-type Zinc Finger Protein ZFP182 is involved in abscisic acid-Induced antioxidant defense in rice[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2012，54（7）：500-510.

[15]Zhang H，Liu Y，Wen F，et al. A novel rice C2H2-type zinc finger protein，ZFP36，is a key player involved in abscisic acid-induced antioxidant defence and oxidative stress tolerance in rice[J]. Journal of Experimental Botany，2014，65（20）：5795-5809.

[16]Sugano S，Kaminaka H，Rybka Z，et al. Stress-responsive zinc finger gene ZPT2-3 plays a role in drought tolerance in petunia[J]. Plant Journal，2003，36（6）：830-841.

[17]賈冠清，刁現(xiàn)民. 谷子[Setaria italica （L.） P. Beauv.]作為功能基因組研究模式植物的發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢[J]. 生命科學(xué)，2017（3）：292-301.

[18]Muthamilarasan M，Bonthala V S，Mishra A K，et al. C2H2 type of zinc finger transcription factors in foxtail millet define response to abiotic stresses[J]. Functional and Integrative Genomics，2014，14（3）：531-543.

[19]Yin M，Wang Y，Zhang L，et al. The arabidopsis Cys2/his2 zinc finger transcription factor ZAT18 is a positive regulator of plant tolerance to drought stress[J]. Journal of Experimental Botany，2017，68（11）：2991-3005.

[20]Zhang D，Tong J，Xu Z，et al. Soybean C2H2-type zinc finger protein GmZFP3 with conserved QALGGH motif negatively regulates drought responses in transgenic Arabidopsis[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7（1237）：325.

[21]Wang F，Tong W，Zhu H，et al. A novel Cys2/His2 zinc finger protein gene from sweetpotato，IbZFP1，is involved in salt and drought tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Planta，2016，243（3）：783-797.