李夏瑩 陳銳 劉鵬程

摘要：轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應用與發(fā)展日新月異，轉(zhuǎn)基因檢測的需求日趨多樣化、復雜化，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)體系已經(jīng)很難滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需要。近年來，以PCR陣列技術(shù)、芯片技術(shù)、DNA測序技術(shù)為代表的轉(zhuǎn)基因高通量檢測技術(shù)發(fā)展迅猛。本文就這一領(lǐng)域的研究進展作一簡要概述。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因;高通量;芯片;DNA測序

中圖分類號： S188 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0027-04

以基因工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)不僅在資源、環(huán)境和醫(yī)藥等方面日益發(fā)揮著重要作用，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應用與發(fā)展也十分迅猛。2016年是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第21年，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積從1996年的170萬hm2迅速上升到至2016年的1.851億hm2，實現(xiàn)了近110倍的增長。2016年也是轉(zhuǎn)基因水果和蔬菜的商業(yè)化快速發(fā)展元年，美國與加拿大先后批準了改善營養(yǎng)指標的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和耐儲存的轉(zhuǎn)基因蘋果的市場銷售。2016年，全球26個國家種植了轉(zhuǎn)基因作物，其中包括19個發(fā)展中國家和7個發(fā)達國家。發(fā)展中國家種植的轉(zhuǎn)基因作物占總面積的54%，而發(fā)達國家占46%。包括中國和印度在內(nèi)的8個亞太地區(qū)國家，在2016年種植了 1 860萬hm2 轉(zhuǎn)基因作物。2016年轉(zhuǎn)基因作物的最大種植國仍然是美國、巴西、阿根廷、加拿大和印度。這5個國家加起來的種植面積達到了全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的91%[1]。截至目前，我國共批準發(fā)放7種轉(zhuǎn)基因作物安全證書，分別是耐儲存番茄、抗蟲棉花、改變花色矮牽牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、轉(zhuǎn)植酸酶玉米和抗蟲水稻，但只有抗蟲棉和抗病毒木瓜實現(xiàn)了大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。二十多年來轉(zhuǎn)基因商業(yè)化進程帶來的巨大經(jīng)濟、社會效益和顯著的生態(tài)效益已充分顯現(xiàn)，它的推廣應用速度之快創(chuàng)造了近代農(nóng)業(yè)科技發(fā)展的奇跡。

伴隨轉(zhuǎn)基因作物種植面積的激增以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)的日益加速，以及轉(zhuǎn)基因標志制度與監(jiān)管需求，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)體系已經(jīng)很難滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需要，影響到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全評價、身份驗證、國內(nèi)監(jiān)管、進出口檢驗、企業(yè)自控和國際貿(mào)易互認，進而影響到國際貿(mào)易和國家利益。因此，開發(fā)快速、精準、高通量的轉(zhuǎn)基因檢測方法，建立相應的檢測技術(shù)體系是當務之急?，F(xiàn)有的高通量轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)主要包括PCR陣列技術(shù)、芯片技術(shù)、DNA測序技術(shù)。本研究就當前該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀做一簡要概述。

1 PCR陣列技術(shù)

聚合酶鏈式擴增技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）是目前應用最廣的轉(zhuǎn)基因方法，包括定性PCR和定量PCR（quantitative PCR，qPCR）。多重PCR（multiplex PCR）可在同一個反應中同時擴增檢測2個或多個目標基因序列，具備高通量檢測的潛質(zhì)。但由于多重qPCR之間的引物干擾，同時在1個反應管中設(shè)計的多重qPCR最多5～6重，很難滿足實際檢測需求。

隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積的激增和品種的日益豐富，檢測需求也隨之擴大，現(xiàn)有的檢測方法通量低、過程繁雜，很難滿足轉(zhuǎn)基因檢測需求。近年來基于qPCR的另一種策略逐步被關(guān)注和報道，即利用內(nèi)含特定引物組合的96孔或384孔預制板用于高通量轉(zhuǎn)基因篩查。預制板內(nèi)含有指定濃度的特異引物，形成規(guī)律性的矩陣，可同時用于同一模板DNA的多重檢測。該方法也被稱為實時定量PCR陣列/芯片法（real-time PCR array），結(jié)合已知的轉(zhuǎn)基因信息列表，這種轉(zhuǎn)基因檢測策略能夠有效地簡化試驗操作，增加檢測通量。

PCR陣列技術(shù)最早由歐盟聯(lián)合研究中心的研究人員于2009年建立。針對歐盟轉(zhuǎn)基因法規(guī)與檢測需求，依據(jù)Decision Support System與JRC GMO-Matrix中的信息，將各轉(zhuǎn)化體、外源基因與元件設(shè)計成最簡化的檢測組合，利用歐盟驗證的事件特異性定量PCR方法，可同時在7種作物中檢測39種轉(zhuǎn)化事件。這種策略能夠有效地增加檢測通量同時降低人為犯錯的風險。后續(xù)的研究證明這種策略能夠有效地檢測加工食品與飼料產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分，在轉(zhuǎn)基因檢測實驗室中被迅速推廣和使用。

Mano等基于96孔預制板設(shè)計了可同時檢測15種轉(zhuǎn)基因玉米、4種轉(zhuǎn)基因大豆和2種轉(zhuǎn)基因油菜的qPCR陣列，共計包含21個事件特異性、13個外源插入基因和5個內(nèi)源基因，檢測低限LOD在0.01%～0.25%之間[2]。

Cottenet等基于384孔板整合了47套qPCR引物和探針，每個孔中進行3重qPCR反應，可同時檢測7個樣本中的47個靶標基因，方法特異性良好，檢測低限LOD低于0.045%[3]。

歐盟聯(lián)合實驗室基于96孔板開發(fā)了最新版本的轉(zhuǎn)基因檢測qPCR陣列，包含7個內(nèi)源基因、5個元件、1個構(gòu)建特異性和3個事件特異性，涵蓋80多個轉(zhuǎn)基因品系，可滿足同時檢測歐盟授權(quán)的全部轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物[4]。其中，96孔預制板由Eurogentec SA公司制作，檢測特異性由Life Technologies公司完成。該方法相對老版本有很大改進，進一步滿足了轉(zhuǎn)基因檢測需求[5-7]。

2 芯片技術(shù)

基因芯片（microarray）又稱DNA芯片（DNA microarray），是芯片技術(shù)中研究最早、最為成熟、應用最廣泛的產(chǎn)品?；蛐酒夹g(shù)通過固體在基質(zhì)表面的上千個特定探針，能夠一次性準確地對樣品中不同種類的DNA序列進行定性、定量篩查，具有高通量、集成化和自動化的特點。相對核酸印跡雜交技術(shù)，基因芯片技術(shù)操作簡單、自動化程度高、檢測效率高，可應用于基因突變檢測、多態(tài)性分析、基因表達譜測定、功能基因組研究等領(lǐng)域。

基因芯片技術(shù)應用于轉(zhuǎn)基因檢測的報道很多，相對PCR技術(shù)，芯片檢測的成本較高，但在檢測通量方面具備巨大優(yōu)勢。

Leimanis等開發(fā)了Silverquant芯片檢測方法用于轉(zhuǎn)基因檢測，該方法利用硝酸鹽沉淀來檢測生物素化的擴增產(chǎn)物，在靈敏度和可信度方面要優(yōu)于熒光染料;該方法覆蓋7個事件特異性、4個轉(zhuǎn)基因元件和5種內(nèi)源基因，LOD在0.03%～0.3%之間[8]。Tengs等設(shè)計了包含了約4萬個探針的Tilling芯片，涵蓋絕大多數(shù)植物轉(zhuǎn)化用的載體序列，可用于篩查未知轉(zhuǎn)化事件[9]。Hamels等評價了Eppendorf公司的DualChip轉(zhuǎn)基因檢測芯片，該產(chǎn)品可一次性進行3個平行試驗，包含12個元件、7個植物內(nèi)源基因、11個事件特異性和6個control對照。該芯片可檢測到1%的植物成分、0.1%的GMO，準確率大于95%[10]。Kim等針對19個轉(zhuǎn)化事件開發(fā)了DNA芯片，包含27個探針用于檢測內(nèi)源基因、35S啟動子、事件特異性和內(nèi)源基因;其中事件特異性檢測包括2個GM大豆、13個GM玉米、3個GM油菜和1個GM棉花，方法檢測低限約為0.5%[11]。Lee開發(fā)的轉(zhuǎn)基因檢測芯片包含4個植物內(nèi)源基因、2個元件和7個外源基因（P35S、tNOS、pat、bar、epsps1、epsps2、pmi、cry1Ac和cry3B），方法特異性良好，靈敏度均可達到0.5%[12]。Turkec等針對3個GM大豆和9個GM玉米開發(fā)檢測芯片，共計設(shè)計了1 830個60 nt的探針，最終篩選出33個探針可用于區(qū)分12個GMO事件，并開發(fā)了1套數(shù)據(jù)算法來實現(xiàn)最大的檢測通量和靈敏度。作者利用該芯片可直接對土耳其市場流通的食品進行轉(zhuǎn)基因定量檢測，檢測靈敏度小于1%[13]。

3 高通量測序技術(shù)

近年來，以Roche/454、Illumina/Solexa和ABI/SOLiD為代表的高通量測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）極大地推動了以動物、植物和微生物為研究對象的生命科學研究[14-17]。相對于傳統(tǒng)DNA測序方法（Sanger法），NGS因其革命性的技術(shù)進步，可在很短的時間內(nèi)產(chǎn)出千萬倍的測序數(shù)據(jù)，從而實現(xiàn)對一個物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組的整體覆蓋和全貌精細研究。目前以NGS技術(shù)為基礎(chǔ)的全基因組測序、基因組重測序、微生物宏基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、小分子RNA測序和表觀基因組測序等手段已廣泛應用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、食品、生態(tài)等多個研究領(lǐng)域。NGS技術(shù)革新了以基因為研究對象的分子生物學及相關(guān)學科研究，策略上實現(xiàn)了由釣魚式到撒網(wǎng)式的點到面的升級，極大地推動了以基因組學與轉(zhuǎn)錄組學為代表的“組學”技術(shù)發(fā)展，使從全基因組尺度開展生命科學研究常態(tài)化[18-20]。

目前國內(nèi)外基于NGS技術(shù)開展轉(zhuǎn)基因檢測的研究報道還比較少。Tengs等利用轉(zhuǎn)錄組測序與差減計算的方法，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中發(fā)現(xiàn)了外源插入片段，理論上證明了NGS技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因檢測[21]。但由于RNA的時空特異性表達與可變剪接等問題，使RNA的序列復雜度極高，直接導致該研究中基于RNA序列的差減分析存在大量的假陽性結(jié)果。Yang等利用NGS技術(shù)對轉(zhuǎn)基因水稻T1c-19和TT51-1進行的分子特征鑒定研究中指出，基于盲檢模型與20倍全基因組測序深度，只能部分識別外源DNA插入片段，并且結(jié)果中存在轉(zhuǎn)基因元件的假陽性判定[22]。

對于大片段轉(zhuǎn)基因的分子鑒定試驗中，染色體步移策略是無法獲取全長信息的，而NGS技術(shù)在轉(zhuǎn)基因分子鑒定領(lǐng)域具備強大優(yōu)勢。Zhang等利用NGS技術(shù)對轉(zhuǎn)基因牛中的1個150 kb的人類乳鐵蛋白進行了分子鑒定，一步獲得外源基因全長序列、整合位點和拷貝數(shù)等信息，結(jié)果通過了事件性PCR和FISH試驗雜交驗證[23]。

Barbau-piednoir等利用NGS技術(shù)對1個未授權(quán)的GM枯草桿菌進行測序，通過Blast比對發(fā)現(xiàn)目的序列，然后設(shè)計引物用于事件性qPCR檢測。結(jié)果證明，這是有效的針對未授權(quán)GMO的檢測策略[24]。Fritsch等利用NGS技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因玉米的純合性，結(jié)果證實NGS策略與qPCR相比更具優(yōu)勢，不需要試驗步驟的優(yōu)化，統(tǒng)計學上也更加可靠[25]。Sahebi等對NGS技術(shù)在植物遺傳育種中的應用進行了綜述指出，NGS能夠解決很多傳統(tǒng)辦法不能解決的問題，但同時大數(shù)據(jù)的安全存儲和繁雜的數(shù)據(jù)分析是對研究者的極大挑戰(zhàn)[26]。Willems等對NGS技術(shù)應用于轉(zhuǎn)基因檢測中的數(shù)據(jù)分析方法進行了討論，作者以轉(zhuǎn)基因水稻為例進行了測序和分析，提出了用于計算P值的公式和用于陽性結(jié)果認定的算法，為NGS技術(shù)在GMO檢測中的應用提供了量化標準[27]。

由于主流轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的基因組較大（例如大豆、玉米等），全基因組無差別測序需要很高的數(shù)據(jù)量才能實現(xiàn)有效的全基因組覆蓋深度，這直接導致了昂貴的測序成本、較高的生物信息學計算負荷和大量無法避免的假陽性結(jié)果。所以，全基因組無差別重測序策略很難實現(xiàn)有效的轉(zhuǎn)基因檢測，在測序之前增加特異性富集步驟十分必要。特異性的富集指定區(qū)段的DNA序列，而后再進行深度測序能夠?qū)μ囟ǖ幕蚪M區(qū)域或感興趣的位點進行針對性研究，相比于全基因組無差別測序，測序目的性更強，測序成本更低，是高效的NGS研究手段[28]。近年來逐步發(fā)展并不斷成熟的相關(guān)測序技術(shù)包括：外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）[29]、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitaion，ChIP）[30]、降解組測序（degradome seuqencing）[31]、DNA甲基化測序（methylated DNA sequencing）[32]和酶切位點相關(guān)DNA測序（restriction-site associated DNA sequencing，RAD-seq）[33]等等。

在NGS測序之前先采取目的片段富集的策略，已在微生物和醫(yī)學領(lǐng)域存在很多報道[34-36]。在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域，針對已知元件或外源基因的上下游序列進行特異性富集，是利用NGS技術(shù)檢測（未授權(quán)）GMO的主要策略。目前按起始基因組DNA的打斷方式可分為3類：直接擴增、隨機打斷和酶切特異性打斷。具體方法包括：（1）長模版快速擴增基因組DNA末端法（long template-rapid amplification of genomic DNA ends，LT-RADE），該方法由RACE技術(shù)演化而來，先利用特異性引物單向外擴，PolyC加尾后再用巢式引物擴增，可獲得插入位點的上下文序列[37];（2）線性擴增介導的PCR法（linear amplification-mediated PCR，LAM-PCR），該方法利用生物素標記特異探針，可以利用磁珠富集一鏈cDNA，使用隨機引物獲得二鏈cDNA后，連接接頭再進行巢式PCR擴增可獲得目標片段[38];（3）非限制性線性擴增介導的PCR法（nonrestrictive linear amplification-mediated PCR，nrLAM-PCR），該方法是LAM-PCR的變種，其中二鏈cDNA并不合成，直接使用單鏈DNA接頭連接一鏈cDNA后進行擴增，該方法的缺點是單鏈DNA連接效率較低[35];（4）位點特異PCR法（SiteFinding-PCR），該方法屬于半隨機引物擴增策略，直接利用基因組上的特異序列與基因特異引物配對，可直接擴增獲得目的片段，一般獲得序列長短不一[39];（5）座位特異PCR法（locus-finding PCR，LF PCR），該方法與SiteFinding-PCR方法類似，但在巢式PCR富集步驟中利用已知序列設(shè)計接頭用于磁珠富集以提高效率，缺點是該方法只能單向擴增獲得一側(cè)序列，一般序列長度小于500 bp[40];（6）高通量的插入追蹤測序法（high-throughput insertion tracking by deep sequencing，HITS），該方法先片段化基因組DNA，經(jīng)末端修復后連接測序接頭，再結(jié)合基因特異引物可擴增插入位點的邊界序列[36];（7）隨機片段PCR擴增法（randomly broken fragment PCR，RBF-PCR），該方法與HITS類似，基因組DNA片段化后加PolyA尾，全部連接測序“Y”形接頭，再經(jīng)巢式PCR擴增后可獲得目標序列[41];（8）AT接頭法（AT-linker PCR），基因組DNA經(jīng)酶切片段化后加A尾，再利用特異引物與OligodT復合引物配對可擴增目的片段[42];（9）環(huán)狀接頭法（loop-linker PCR），該方法與AT接頭法類似，酶解基因組DNA后直接使用帶黏性末端的環(huán)狀接頭與之連接，再經(jīng)巢式PCR擴增可獲得目的片段[43];（10）TOPO載體連接PCR法（TOPO vector ligation PCR），該方法與A-T linker法類似，但使用一個平末端載體來代替A-T linker，使用載體的上引物與目的基因特異引物配對，可擴增目的片段[44];（11）探針雜交測序法（Southern-by-Sequencing，SbS），利用已知目標序列設(shè)計～70 nt探針，用于雜交富集DNA片段再測序，該方法不需要PCR擴增，但必須要預制插入位點附近的序列，不適用于未知轉(zhuǎn)基因檢測[45-46]。

總的來說，目前NGS技術(shù)在GMO檢測上的應用還很有限，DNA富集策略必須依賴預知元件，還沒有非常便捷、低成本的靶標富集方法。GM檢測一般需要0.1%的靈敏度和高通量需求，最好能夠分析混合物種樣本（例如玉米和大豆混樣），要想實現(xiàn)上述技術(shù)要求，NGS技術(shù)還需要在低成本、高效和寬靶標等方向有所進步。NGS技術(shù)為GM檢測打開了新的大門，雖然還存在很多技術(shù)瓶頸，但可以預見在不久的未來，隨著測序成本的不斷下降，NGS技術(shù)必將成為轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域的主流技術(shù)。

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