邵天舒，周長明，余立，郭雷（北京市藥品檢驗所中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京102206）

因來源和組分的復(fù)雜性，由動物組織器官提取制備的多組分生化藥已成為備受學(xué)者關(guān)注的焦點和相關(guān)藥品質(zhì)量控制研究的熱點[1]。小牛血去蛋白提取物是將新生小牛靜脈血去除蛋白質(zhì)后，經(jīng)透析、濃縮、超濾等工藝制成的含有小分子多肽、氨基酸及無機元素等的混合物，該藥主要用于腦缺血、癡呆、腦外傷及大腦功能不全等腦細胞代謝障礙性疾病的治療[2]。目前，有關(guān)該藥質(zhì)量控制方面的研究主要為其活性組分如多肽、氨基酸以及鈉鉀離子的含量檢測[3-4]，而對于其中元素控制方面尚無文獻報道，且現(xiàn)行國家藥品標準WS1-XG-029-2000和進口藥品注冊標準JX20030248中也未見對該藥中元素控制的相關(guān)項目[5-6]。

近年來，隨著環(huán)境污染日益嚴重，動物在養(yǎng)殖過程中的飲用水、飼料受到有害元素如汞（Hg）、鉛（Pb）、砷（As）、鎘（Cd）、鋁（Al）等污染的概率也隨之增加，且金屬元素易與動物體內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)等成分螯合，使得金屬元素在動物組織器官來源的藥物中形成殘留[7]。過量的Hg可危害人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，As則會影響細胞代謝，Pb對神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和造血系統(tǒng)都有毒性作用，Cd中毒可能會導(dǎo)致腎功能損傷及骨骼軟化[8]，Al在體內(nèi)的蓄積可能具有引發(fā)軟骨病、低血色素性貧血、老年性癡呆和慢性腎功能損傷等潛在風險[9]?，F(xiàn)行2015年版《中國藥典》（四部）通則“0102”對中藥注射劑中部分元素按每日最大使用量進行逐一限量規(guī)定[10]。因此，對小牛血去蛋白提取物注射液中元素進行監(jiān)測對保障用藥安全具有重要意義。

電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）具有靈敏、準確、快速的優(yōu)點，已成為同時測定多種痕量元素含量的首選方法[11-12]。本研究采用ICP-MS法同時測定了國內(nèi)外3家企業(yè)24批小牛血去蛋白提取物注射液中Cd、Pb、As、Hg、鈷（Co）、釩（V）、鎳（Ni）、鉈（Tl）、銀（Ag）、鉬（Mo）、銅（Cu）、鉻（Cr）、鋇（Ba）、Al等14種元素的含量，旨在為深入研究該藥中各元素的分布及來源、臨床用藥的安全性評估及質(zhì)量標準的提升提供依據(jù)，為類似的多組分生化藥中多種元素的控制提供參考，為注射劑仿制藥一致性評價中的元素控制提供支持。

1 材料

1.1 儀器

NexlON 300X型ICP-MS儀，包括霧化器、四級桿、檢測器（美國Perkin Elmer公司）；WD-A型藥物穩(wěn)定性檢查儀（天津藥典標準儀器廠）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q型超純水機（美國Millipore公司，電阻率：18.2 MΩ·cm）。

1.2 藥品與試劑

小牛血去蛋白提取物注射液（進口A企業(yè)，批號：00911015、00921015、00931015、00941015、00951015、00961015、00971015、00991115、10923971、10924161、10924163、10946880、10946882、10958367、10960009，規(guī)格：10 mL∶400 mg，編號：S1～S15；國產(chǎn) B 企業(yè)，批號：181013-2、181014-2、181015-2、1705003-2、1705004-2、1705005-1，規(guī)格：10 mL∶400 mg，編號：S16～S21；國產(chǎn)C企業(yè)，批號：10618023-2，規(guī)格：5 mL∶200 mg；批號：10718065-3、10718079-2，規(guī)格：10 mL∶400 mg；編號：S22～S24）；Hg標準品溶液（中國計量科學(xué)研究院，批號：GBW08617/18031，質(zhì)量濃度：1 000 μg/mL）；Cd、Pb、As、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al混合標準溶液（批號：3-122MKBY2，質(zhì)量濃度均為10 μg/mL）以及鉍（Bi）、鍺（Ge）、銦（In）、銣（Lu）、銠（Rh）、鈧（Sc）混合內(nèi)標貯備液（批號：3-62MKBY2，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）均購自美國Agilent公司；金（Au）標準品溶液（美國Inorganic Ventures公司，批號：K2-AU04064，質(zhì)量濃度：1 000 μg/mL）；硝酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS條件

射頻功率：1 350 W；載氣（氬氣）流量：1.1 L/min；碰撞氣（氦氣）流量：4.5 L/min；積分時間：1.5 s；等離子體氣流量：18 L/min；采樣深度：65 mm；進樣蠕動泵轉(zhuǎn)速：24.0 r/min；數(shù)據(jù)采樣模式：跳峰模式；重復(fù)次數(shù)：3次。各元素分析參數(shù)見表1。

表1 各元素分析參數(shù)Tab 1 Analytical parameters of each element

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標溶液 精密量取混合內(nèi)標貯備液1 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得各內(nèi)標元素質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的內(nèi)標溶液。

2.2.2 混合標準品溶液 精密量取混合標準溶液0.5mL，置于10 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得各元素質(zhì)量濃度均為500 μg/L的混合標準品貯備液。精密量取Hg標準品溶液1 mL，置于20 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，取1 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為500 μg/L的Hg標準品貯備液。分別精密量取上述混合標準品貯備液及Hg標準品貯備液0.01、0.1、0.2、1、4、10、14 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加入“2.2.1”項下內(nèi)標溶液及Au穩(wěn)定劑溶液（取Au標準品溶液適量，加1%硝酸溶液定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為1 μg/mL的Au穩(wěn)定劑溶液）各1 mL，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得各元素質(zhì)量濃度分別均為0.05、0.5、1、5、20、50、70 μg/L的系列混合標準品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密量取樣品2 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加入“2.2.1”項下內(nèi)標溶液和“2.2.2”項下Au穩(wěn)定劑溶液各1 mL，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 空白溶液 以1%硝酸溶液為空白溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

取“2.2.2”項下系列混合標準品溶液各適量，按“2.1”項下ICP-MS條件連續(xù)進樣，記錄儀器響應(yīng)值。以各待測元素質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標、各待測元素與內(nèi)標的響應(yīng)值比值（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equation and linear range

2.4 定量限與檢測限考察

取“2.2”項下空白溶液和系列混合標準品溶液各適量，按“2.1”項下ICP-MS條件連續(xù)進樣測定10次，記錄儀器響應(yīng)值并計算標準偏差。以標準偏差與標準曲線斜率之比的10倍對應(yīng)的元素質(zhì)量濃度作為定量限，以標準偏差與標準曲線斜率之比的3倍對應(yīng)的元素質(zhì)量濃度作為檢測限，結(jié)果見表3。

表3 定量限與檢測限結(jié)果Tab 3 Quantitation limits and detection limits

2.5 精密度試驗

精密量取“2.2.2”項下混合標準品溶液（質(zhì)量濃度為20 μg/L）適量，按“2.1”項下ICP-MS條件連續(xù)進樣測定6次，記錄儀器響應(yīng)值。結(jié)果，Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al儀器響應(yīng)值的 RSD 分別為3.6%、4.2%、1.5%、3.7%、3.7%、2.2%、0.4%、1.6%、3.4%、0.9%、2.7%、2.1%、1.5%、0.8%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密量取“2.2.3”項下供試品溶液（編號：S24）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時按“2.1”項下ICPMS條件進樣測定，記錄儀器響應(yīng)值。結(jié)果，Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al儀器響應(yīng)值的RSD分別為3.2%、4.0%、1.9%、7.8%、2.2%、3.0%、2.1%、1.9%、4.2%、2.0%、3.4%、2.5%、3.6%、3.8%（n＝6），表明供試品溶液于室溫放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

精密量取樣品（編號：S24）1 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應(yīng)值并按內(nèi)標法計算樣品中14種元素的含量。結(jié)果，Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al的平均含量分別為0.201 5、0.091 3、0.100 4、0.077 6、0.039 4、0.094 6、0.998 9、0.115 1、0.280 6、0.412 6、0.034 9、1.625 3、5.999 4、14.146 6 μg/L，儀器響應(yīng)值的RSD分別為4.4%、6.4%、2.8%、5.4%、4.8%、3.8%、1.6%、3.9%、4.0%、1.0%、2.6%、2.2%、2.8%、1.5%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的樣品（編號：S24）2 mL，共9份，分別置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合標準品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應(yīng)值并計算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 4 Results of recovery tests（n＝9）

續(xù)表4Continued tab 4

續(xù)表4Continued tab 4

2.9 樣品含量測定

取24批樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應(yīng)值并按內(nèi)標法計算樣品中各元素的含量，結(jié)果見表5（表中，“-”表示未檢出，下同）。

2.10 每日最大暴露量（PDE）分析

國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）發(fā)布的指導(dǎo)原則“Q3D”中將藥品所含的元素（除Al外）按其風險由高到低分為1類（包括Cd、Pb、As、Hg）、2A類（包括Co、V、Ni、Tl）、2B 類（Ag）及 3類（包括 Mo、Cu、Cr、Ba），并對各元素按口服、注射、吸入等3種不同劑型分別規(guī)定了PDE[13]。按照該指導(dǎo)原則，根據(jù)公式：PDE＝樣品中各元素的質(zhì)量濃度×日服用劑量，將表5中（除Al外）各元素的含量結(jié)果進行換算，結(jié)果見表6。

由表6可知，24批樣品中13種元素均未超過出ICH的限量值[13]。國產(chǎn)C企業(yè)的3批樣品中Cd含量分別達到限量值的25%、40%、25%，Pb、As、Hg均未超過ICH限量值的15%，其他元素均未超過ICH限量值的20%。提示該藥含有的元素含量水平雖然存在差異，但均低于ICH限量值，因此該藥用于臨床是安全的。

表5 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，μg/L）Tab 5 Results of content determination of samples（n＝3，μg/L）

2.11 Al含量分析

將24批樣品（與已測定的樣品同批號但未開封）分別于25、45 ℃放置60 d后，取適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應(yīng)值并按內(nèi)標法計算樣品中Al的含量，結(jié)果見表7。

Al在ICH指導(dǎo)原則Q3D中被認定為“可能導(dǎo)致?lián)p傷的其他元素雜質(zhì)”[13]，但未給出限量值，其限量值可遵從其他指導(dǎo)原則和/或地方法規(guī)和規(guī)范，如現(xiàn)行《美國藥典》（41版）規(guī)定了全腸外營養(yǎng)治療用大容量注射液中Al含量限量為 25 μg/L[14]；《歐洲藥典》（9.0版）和 2015 年版《中國藥典》（三部）均規(guī)定人血白蛋白注射液中Al含量限量為200 μg/L[10，15]。因此，小牛血去蛋白提取物注射液說明書參照上述文獻的規(guī)定，設(shè)定Al含量限量為200 μg/L。

由表7可知，3家企業(yè)各批樣品中Al含量在放置60 d后均有所升高。25℃條件下，A、B、C企業(yè)樣品中Al含量分別平均升高了14.8%、2.5%、67.9%；45℃條件下，分別平均升高了51.5%、19.1%、165.8%，放置前Al含量較高的在放置后升高程度越明顯。國產(chǎn)B企業(yè)樣品在放置前Al含量最低，45℃放置60 d后，Al含量的最高值為113.513 μg/L（編號：S20），仍未超過200 μg/L的限量值；所有企業(yè)中，僅國產(chǎn)B企業(yè)6批樣品中的Al含量符合上述限量要求。

表6 13種元素的PDE（μg/d）Tab 6 Permitted daily exposure of 13 elements（μg/d）

表7 不同溫度條件下放置60 d后Al含量比較（n＝3）Tab 7 Comparison of aluminium content after 60 days storage at different temperatures（n＝3）

3 討論

3.1 樣品前處理方式的選擇

前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，采用微波消解樣品后，雖然可以使樣品中的肽類成分得到有效破壞，但消解過程中使用的硝酸會引入一定量的待測元素，而造成空白值明顯升高，加之濃酸的揮發(fā)以及溶液轉(zhuǎn)移過程可能會造成樣品中待測元素損失，進而使樣品測定結(jié)果的準確度降低，因此微波消解法并不適用。另外，由于樣品中添加的輔料為2.68%氯化鈉，這超出了ICP-MS儀器測定樣品時的溶液含鹽量限量（不超過0.05%），因此直接測定法不適用。綜合考慮，筆者分別嘗試將樣品經(jīng)1%硝酸溶液稀釋10倍、20倍、50倍和100倍后進樣測定。結(jié)果顯示，當樣品稀釋10倍或20倍時，部分元素的加樣回收率接近150%，且內(nèi)標元素的響應(yīng)值與標準品溶液測定時比較明顯降低，提示基質(zhì)干擾較嚴重；當樣品稀釋100倍時，由于稀釋度過大，使得樣品中部分元素的測定結(jié)果低于定量限，而影響測定的準確性。因此，選擇將樣品稀釋50倍后測定，經(jīng)方法學(xué)驗證均符合2015年版《中國藥典》（四部）的相關(guān)要求[10]。

3.2 測量模式的選擇

前期預(yù)試驗中，筆者采用標準模式和動能歧視模式對各待測元素進行方法學(xué)驗證。結(jié)果顯示，采用動能歧視模式測定時，As、V、Cr等3種元素的檢測限均低于標準模式一個數(shù)量級以上，其他元素采用兩種模式測定時則無明顯差異?？紤]到碰撞氣（氦氣）價格較為昂貴，以及為提高檢測結(jié)果的準確度，最終選擇動能歧視模式測定As、V、Cr，采用標準模式測定其他11種元素。

3.3 Al含量結(jié)果分析

本研究結(jié)果顯示，國產(chǎn)B企業(yè)的6批樣品中Al含量（編號：S16～S21）符合規(guī)定（Al含量限量為200 μg/L），進口A企業(yè)和國產(chǎn)C企業(yè)的樣品均超出限量值，特別是國產(chǎn)C企業(yè)的3批樣品（編號：S22～S24）中Al含量均高達限量值的3～4倍。其原因可能為各企業(yè)使用的玻璃容器質(zhì)量不同，在放置過程中，玻瓶容器中的金屬離子向藥品發(fā)生了遷移。不同企業(yè)生產(chǎn)的樣品中Al含量差異較大，部分企業(yè)的樣品中Al含量超過限量值問題應(yīng)引起重視，特別是靜脈注射劑中過量的Al長期直接注入血液，可引起骨軟化、阿爾茨海默病、低色素性貧血、慢性腎功能損傷等潛在風險[16]，因此在現(xiàn)行質(zhì)量標準中增加對Al含量進行監(jiān)控就顯得十分必要。此外，3家企業(yè)樣品的保質(zhì)期各有不同，國產(chǎn)B企業(yè)為18個月，C企業(yè)為24個月，進口A企業(yè)為60個月。由于玻瓶容器中Al可隨貯藏時間的延長而不斷浸出，因此建議重新設(shè)定該樣品的有效期，以保障用藥的安全性。

綜上所述，該方法操作簡便、準確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，可用于同時測定小牛血去蛋白提取物注射液中14種元素的含量。