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果酒酵母菌多菌種混合培養(yǎng)的生長規(guī)律及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異性分析

2019-08-12 08:52白夢洋吳祖芳李若云熊國通翁佩芳
中國食品學(xué)報 2019年5期
關(guān)鍵詞:醇類果酒酵母菌

白夢洋 吳祖芳 李若云 熊國通 翁佩芳

(寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室 浙江寧波 315211)

果酒的風(fēng)味是衡量果酒品質(zhì)的最重要特征之一,其風(fēng)味成分十分豐富,由果酒酵母發(fā)酵形成的風(fēng)味物質(zhì)影響果酒的化學(xué)特性和感官特性[1]。果酒的香氣成分主要由兩類組成,一類是萜烯類化合物,是由釀酒使用的原料品種及產(chǎn)地決定,而更多的風(fēng)味來源于二類香氣物質(zhì),主要包括醇類、酯類、酸類、醛酮類、脂肪酸、揮發(fā)性酚類、含硫化合物、烴類、羰基化合物及雜環(huán)類化合物等,其種類和產(chǎn)量與所用酵母密切相關(guān)[2-4]。果酒香氣的形成是一個復(fù)雜的內(nèi)部反應(yīng),由多種揮發(fā)性化合物以及這些化合物之間通過各種方式相互作用,最終形成果酒的香氣和風(fēng)味[5]。

傳統(tǒng)果酒的發(fā)酵是一個復(fù)雜的多種微生物共同作用的過程,酵母在其中起著重要的作用,是影響果酒風(fēng)味獨特性的最主要因素。與單菌種發(fā)酵相比,酵母的混合發(fā)酵能表現(xiàn)出更好的特性,如增加甘油含量和總酸度及產(chǎn)生多種酯類、酮類、揮發(fā)性酚類等特殊物質(zhì),改善果酒的質(zhì)量和品質(zhì),增強果酒風(fēng)味多樣性[6-8]。在葡萄酒釀造過程中,釀酒酵母表現(xiàn)出很弱的β-葡萄糖苷酶活性,因此在發(fā)酵完成后大多數(shù)葡萄糖苷風(fēng)味前體物質(zhì)仍未被水解,而接種Debaryomyces vanriji后,能產(chǎn)生較高活力的β-葡萄糖苷酶,從而有效地釋放出風(fēng)味化合物[9]。Garcia等[10]研究發(fā)現(xiàn),采用酵母菌聯(lián)合發(fā)酵72 h后,酶活力是對照葡萄酒中的2倍,且聯(lián)合培養(yǎng)發(fā)酵液中的幾種酸、醇、酯和萜烯醇的濃度明顯增強,使果酒的風(fēng)味得以增強和改善。

作者所在團隊在前期研究中已篩選獲得對發(fā)酵風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的畢氏酵母菌65(Pichia fabianii 65,簡稱Pf)和東方伊薩酵母菌(Issatchenkia orientalis 166,簡稱Io)以及酒精發(fā)酵的重要菌株——釀酒酵母菌131(Saccharomyces cerevisiae 131,簡稱Sc),在細(xì)胞混合培養(yǎng)相互影響因素及轉(zhuǎn)錄組測序研究基礎(chǔ)上(另文發(fā)表),進(jìn)行單菌種及混合培養(yǎng),分析酵母菌混合發(fā)酵時生長變化規(guī)律和揮發(fā)性風(fēng)味代謝產(chǎn)物。本研究結(jié)果可豐富果酒釀造混合菌發(fā)酵技術(shù)理論及探明風(fēng)味發(fā)酵形成的微生物作用機制,對改善果酒品質(zhì)和提高果酒釀造技術(shù)水平具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種:釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)131(簡稱 Sc)、畢氏酵母菌(Pichia fabianii) 65(簡稱Pf)、 東方伊薩酵母菌 (Issatchenkia orientalis)166(簡稱Io)均保藏于寧波大學(xué)海洋學(xué)院食品生物技術(shù)實驗室。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基 (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium,YPD):葡萄糖 20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L(固體加入20 g/L瓊脂粉),pH 5.5±0.2。

含山梨醇的基本培養(yǎng)基 (minimal medium,MM):5 g/L 蛋白胨、1 g/L 酵母浸粉、15 g/L 瓊脂、5 g/L山梨醇,pH 5.5±0.2。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計,上海精密科學(xué)儀器有限公司;電子天平,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;島津QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津公司;LDZX-40BⅠ型立式蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;XPX智能型生化培養(yǎng)箱,寧波江南儀器廠;高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司;超聲波振蕩儀,昆山市淀山湖檢測儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化 取甘油保藏菌種,劃線于YPD固體培養(yǎng)基上,于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,取一環(huán)平板活化的菌體于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中,30℃,150 r/min恒溫培養(yǎng)24 h后于4℃冰箱中保藏備用。

1.3.2 發(fā)酵方法及生長的測定 將活化好的酵母菌以同等比例混合接種于裝有50 mL滅菌YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,并分別接種3種酵母菌作為純培養(yǎng)對照,30℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)?;旌吓囵B(yǎng)及純培養(yǎng)接種后培養(yǎng)液起始濃度均為2×105CFU/mL。

細(xì)胞數(shù)量測定采用平板計數(shù)法。在混合培養(yǎng)條件下,因釀酒酵母Sc和非釀酒酵母Pf生長形態(tài)一致,肉眼難以區(qū)分,而Sc在含山梨醇的培養(yǎng)基上不能正常生長,Pf可以正常生長,故采用含山梨醇的基本培養(yǎng)基進(jìn)行選擇計數(shù)。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測 固相微萃取:取3 mL發(fā)酵液樣品于15mL頂空樣品瓶中,將裝有PDMS萃取頭的SPME手動進(jìn)樣器的針頭通過隔墊插入瓶中,推出纖維頭,于50℃ 恒溫吸附40 min,再移至20℃恒溫水浴鍋中平衡10 min,縮回纖維頭,并迅速將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)行分析。

GC 條件:色譜柱為 Vocol1.8 μm×60 m×0.32 mm,0.32 mm;柱溫:起始溫度 35℃,保持 3 min,然后以3℃/min升至40℃,保持1 min,再以5℃/min升至210℃,保持16 min;載氣:氦氣;流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣口溫度:210℃。

MS條件:電離方式為EI+,電子能量70 eV,接口溫度210℃,離子源溫度200℃,檢測器電壓0.8 kV;質(zhì)譜掃描范圍:30~650amu;檢索譜庫:WILEY和NIST譜庫。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗平行進(jìn)行3次,利用SAS 8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,Mev 4.9.0進(jìn)行熱圖歸納分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同混合培養(yǎng)條件下酵母菌的生長變化

考察3種酵母菌純培養(yǎng)及不同混合培養(yǎng)條件下生長曲線,結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出,在發(fā)酵過程中,3種酵母菌均在12 h進(jìn)入穩(wěn)定期。純培養(yǎng)時,Pf和Sc均在24 h達(dá)到最大成長量,分別為2.3×108CFU/mL和4.5×107CFU/mL,而Io在 20 h達(dá)到最大生長量1.0×108CFU/mL。在3種酵母混合培養(yǎng)體系,酵母生長量均未達(dá)到其純培養(yǎng)時的生長量,這是由于混菌培養(yǎng)時三者相互競爭營養(yǎng)資源且相互抑制造成的[11]。非釀酒酵母Pf在競爭中處于優(yōu)勢地位,最大生長量為1.9×108CFU/mL,基本達(dá)到其純培養(yǎng)時生長量。Io生長受到一定程度的抑制,為6.5×107CFU/mL。釀酒酵母Sc生長受到嚴(yán)重抑制,僅為6.8×106CFU/mL。以上說明在三者混合培養(yǎng)時,非釀酒酵母Pf生長最為良好,而其它兩種酵母均受到不同程度的抑制。據(jù)研究報道,畢赤酵母能耐受低pH、低水分活度、高滲透壓、厭氧等極端環(huán)境,相比于釀酒酵母更能適應(yīng)外界環(huán)境脅迫[12],且發(fā)酵過程中,非釀酒酵母產(chǎn)生的中長鏈脂肪酸、寡聚肽、乳酸、環(huán)化高級醇等可能會抑制其它菌種的生長[13],因此在混合培養(yǎng)競爭時處于優(yōu)勢地位。

圖1 不同混合培養(yǎng)方式的酵母菌生長動態(tài)變化Fig.1 Dynamic growth changes of yeasts by different culture

在兩兩混合培養(yǎng)體系中,非釀酒酵母均能良好生長,生長量和純培養(yǎng)時基本一致。在Sc和Pf混合體系中,Pf最大為 1.8×108CFU/mL,Sc 僅為6.4×106CFU/mL。 在 Sc和 Io混合時,Io最大為8.2×107CFU/mL,Sc 為 9.3×106CFU/mL。 可以看出,Pf對釀酒酵母Sc的抑制程度更高,一些研究證明非釀酒酵母在發(fā)酵初期會產(chǎn)生一些有毒化合物,類似糖蛋白、多肽、小分子質(zhì)量的信號分子等會抑制釀酒酵母的生長[14]。在后續(xù)試驗中,非釀酒酵母生長量不斷降低,逐漸被酒精耐受能力較高的釀酒酵母所取代,這可能是由于環(huán)境中酒精濃度升高,有機酸積累等導(dǎo)致的非釀酒酵母的衰亡[15]。

2.2 不同培養(yǎng)方式下?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析

香氣作為果酒品質(zhì)最重要的特征之一,代表多種揮發(fā)性物質(zhì)的總和,混菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生、增強一些有益風(fēng)味化合物如乙酸苯乙酯等,降解某些異味物質(zhì)如乙醛等,最終改變發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味特征[16]。對3種酵母分別純培養(yǎng)、兩兩混合培養(yǎng)及三者混合培養(yǎng),取穩(wěn)定期發(fā)酵液,處理后用氣相色譜法分析揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分。將得到的色譜及質(zhì)譜圖與WILEY和NIST檢索譜庫分析比對,采用面積歸一化法計算各成分的相對含量,結(jié)果見表1。作代謝熱圖分析見圖2。

表1 不同培養(yǎng)方式的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析Table1 Volatile flavor components by different culture methods

(續(xù)表1)

由表1、圖2可以看出,不同培養(yǎng)方式所產(chǎn)生的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)目及含量有所不同,共檢測出57種揮發(fā)性物質(zhì)成分,其中醇類16種,醛類5種,酯類19種,酮類7種,酸類4種,其它成分6種。其中22種是共有的香味物質(zhì),6種為釀酒酵母Sc所獨有,11種為非釀酒酵母Io所獨有,4種為非釀酒酵母Pf所獨有。

在兩兩混合培養(yǎng)體系中,Io與Sc混合培養(yǎng)和Io純培養(yǎng)體系揮發(fā)性物質(zhì)成分相似度較高,Pf與Sc混合培養(yǎng)和Pf純培養(yǎng)體系揮發(fā)性物質(zhì)成分相似度較高,推測可能是由于Io和Pf對Sc產(chǎn)生抑制,這與前期試驗結(jié)果相符。在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測中,含量比例占最高的是醇類和酯類,分別檢測到16種和19種。其中釀酒酵母Sc所產(chǎn)生的醇類最多,醇作為酵母代謝產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物[17],達(dá)71.80%;非釀酒酵母Io為64.28%,Pf為43.61%,說明釀酒酵母較非釀酒酵母代謝產(chǎn)生的醇類物質(zhì)能力強,3種酵母產(chǎn)生醇類含量最多的均為乙醇、異戊醇、2-甲基-1-丁醇和苯乙醇,苯乙醇具有花香,且具有一定的殺菌能力,會發(fā)出誘人且香甜的茉莉花香,有柔和愉悅的感受[18]。有研究表明,少量高級醇能賦予果酒特殊的香氣,同時也是其它香氣物質(zhì)的良好溶劑,它們的嗅覺閾值一般很低,香氣值較高,對風(fēng)味組成具有重要作用[19]。揮發(fā)性酯類作為香氣化合物的重要組成,賦予果酒特殊的水果香氣,對果酒風(fēng)味貢獻(xiàn)最大,在酯類物質(zhì)檢測中,單獨培養(yǎng)時,非釀酒酵母Pf可產(chǎn)生大量的乙酸乙酯,占31.1%,有濃郁的菠蘿香氣[20]。Pf和Sc混合培養(yǎng)時,乙酸乙酯含量有所升高,占34.61%,乙酸異戊酯相對含量由7.42%升為10.04%,具有一定的香蕉香氣[21]。兩兩混合培養(yǎng)時,產(chǎn)生的酯類物質(zhì)整體上較純培養(yǎng)時多,可見混合發(fā)酵可豐富酒體的酯類物質(zhì)風(fēng)味,例如產(chǎn)生具有清甜蘋果香氣的甲酸乙酯及杏仁香的乙酸苯甲酯等[22]。此外,混合培養(yǎng)時,酸類和酮類的也發(fā)生一些變化,其種類和相對含量與單獨培養(yǎng)時有所不同,酸類和酮類均為烷烴類有機化合物氧化的最終產(chǎn)物,屬于果酒中典型的呈味物質(zhì),特別是乙酰丙酮、呋喃酮對果酒風(fēng)味貢獻(xiàn)較高[23]。在醛類物質(zhì)檢測中,不同培養(yǎng)方式的乙醛都占有很高比例,其對香氣起著重要作用,同時,乙醛也是乙酸、乙偶姻合乙醇的合成前體,低含量的乙醛就能起到很好的媒介功能[24]。

圖2 不同培養(yǎng)方式的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)代謝熱圖Fig.2 H-Clustering-Heat Map of volatile flavor components by different culture methods

將3種酵母作混合培養(yǎng)處理時,可以看出醇類相對含量有所下降,占41.32%,均低于單獨及兩兩培養(yǎng)時的醇類含量,推測產(chǎn)醇類的釀酒酵母可能受到明顯抑制。酯類相對含量顯著增加,達(dá)56.34%,其中含量最高的是乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯和乙酸丙酯,分別為32.15%,11.72%,3.71%和2.68%,含量均高于純培養(yǎng)或兩兩混合培養(yǎng),說明3種酵母混合可大大增強果酒發(fā)酵的特殊風(fēng)味。此外,在培養(yǎng)過程中,也發(fā)現(xiàn)酚類、吡嗪及含硫化合物,這些物質(zhì)的閾值很低,具有強烈的芬芳,例如甲基乙基吡嗪、3-甲酚等產(chǎn)生的泥土味、金屬味等特殊氣味共同構(gòu)成果酒發(fā)酵獨特的風(fēng)味[25]。

3 結(jié)論

比較釀酒酵母Sc和非釀酒酵母Pf、Io純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)時的生長差異,結(jié)果表明,兩兩混合培養(yǎng)時,非釀酒酵母均能良好生長,生長量和純培養(yǎng)基本一致,而釀酒酵母Sc受到不同程度的抑制,且Pf對釀酒酵母的抑制程度更高;三者混合培養(yǎng)時,由于相互競爭營養(yǎng)資源且相互抑制,所以3種酵母均未達(dá)到其純培養(yǎng)時生長量,非釀酒酵母Pf在競爭中處于優(yōu)勢地位,Io生長受到抑制,釀酒酵母Sc受抑制程度嚴(yán)重。

從不同混合方式發(fā)酵的菌種中共檢測到57種揮發(fā)性物質(zhì)成分,其中醇類16種、醛類5種、酯類19種、酮類7種、酸類4種和其它6種,有22種是共有的香味物質(zhì),6種為釀酒酵母Sc所獨有,11種為非釀酒酵母Io所獨有,4種為非釀酒酵母Pf所獨有。Io與Sc混合培養(yǎng)和Io純培養(yǎng)相比揮發(fā)性物質(zhì)成分相似度較高,Pf與Sc混合培養(yǎng)和Pf純培養(yǎng)相比揮發(fā)性物質(zhì)成分相似度較高,相對含量比例最高的是醇類和酯類,釀酒酵母Sc產(chǎn)生的醇類最高達(dá)71.80%,非釀酒酵母Io為64.28%,Pf為43.61%。3種酵母產(chǎn)生醇類含量最多的依次為乙醇、異戊醇、2-甲基-1-丁醇和苯乙醇,酯類物質(zhì)中乙酸乙酯和乙酸異戊酯含量最高,提供果酒特殊風(fēng)味。3種酵母混合培養(yǎng)時醇類相對含量有所下降,占41.32%,均低于單獨及兩菌混合培養(yǎng)時的醇類含量,而酯類相對含量顯著增加,達(dá)56.34%,其中含量最高的是乙酸乙酯(32.15%)、乙酸異戊酯(11.72%)、乙酸苯乙酯(3.71%)和乙酸丙酯(2.68%),均高于純培養(yǎng)或兩菌混合培養(yǎng),說明3種酵母菌混合培養(yǎng)可大大增強果酒發(fā)酵的特殊風(fēng)味。此外,也發(fā)現(xiàn)酚類、吡嗪及含硫化合物共同構(gòu)成果酒發(fā)酵獨特的風(fēng)味。

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