熊 科 支慧偉 王小藝 趙峙堯 柳佳蕓 裴鵬剛 鄧 蕾 李秀婷

（1北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京 100048

2北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京 100048

3北京工商大學(xué) 北京市風(fēng)味化學(xué)重點實驗室 北京 100048

4北京工商大學(xué) 北京市質(zhì)量與安全重點實驗室 北京 100048）

赭曲霉毒素是一類由曲霉和青霉等絲狀產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其中赭曲霉毒素A（Ochratoxins，OTA）的毒性最強，主要污染谷物、咖啡豆、堅果、可可、葡萄及相關(guān)產(chǎn)品[1]。經(jīng)食品法典委員會認定，OTA污染最為嚴重的食品類別依次為谷類＞葡萄及其制品＞咖啡豆及其制品＞其它[2]。動物試驗表明：OTA的主要靶器官為腎臟和肝臟，具有致癌、致畸和致突變性。降低或脫除食品及其原料中的OTA含量對保障食品安全意義重大[3-7]。傳統(tǒng)降解OTA的方法主要是物理化學(xué)方法，該方法存在二次污染和解毒不徹底等問題，在食品行業(yè)中的應(yīng)用受較大局限。而生物脫毒法不破壞產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，具有脫毒高效、特異性強等優(yōu)點，受到越來越多研究者的關(guān)注，具有廣闊的應(yīng)用前景[8-9]。

生物脫毒法，主要包括生物的物理吸附和降解。由于生物吸附的可逆性，因此生物降解才是最徹底的脫毒方法。目前研究較多的生物降解的微生物菌株主要有黑曲霉 （Aspergillus niger）[10]、芽孢桿菌（Bacillus spp.）[11]、乳酸菌（Lactic acidbacteria）[12]、紅發(fā)夫酵母（Phaffia rhodozyma）[13]等。 這些微生物菌株均能脫除OTA，其脫毒機制有待進一步研究。也有研究表明，部分蛋白酶也存在降解OTA的作用，其中來源于牛胰臟的羧肽酶（CP；EC.3.4.17.1）是研究最早的OTA 降解酶[14]?，F(xiàn)在許多研究將CP作為篩選OTA降解菌株的對照酶。如Luis Abrunhosa[15]在篩選降解OTA的黑曲霉時便采用CP作為菌株篩選的對照。

CP是一類能水解蛋白質(zhì)和多肽底物C端芳香族或中性脂肪族氨基酸殘基釋放C端氨基酸的酶，它的活性與鋅離子有關(guān)。動物來源的羧肽酶的數(shù)量非常有限且價格昂貴，導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制；而微生物來源的羧肽酶具有廣闊的應(yīng)用前景。借助基因工程策略，采用微生物為宿主大量生產(chǎn)重組羧肽酶，有望克服羧肽酶生產(chǎn)過程所遇到的動、植物原料來源受限等問題，進一步降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量，擴展其應(yīng)用范圍。然而，天然羧肽酶穩(wěn)定性差，易失活，不能重復(fù)使用，反應(yīng)后混入產(chǎn)品，純化困難，使其難以在工業(yè)中更為廣泛的應(yīng)用。此外，分離和提純酶以及它們的一次性使用又大大增加了其作為催化劑的成本。固定化羧肽酶是實現(xiàn)其在食品領(lǐng)域應(yīng)用的研究重點。目前羧肽酶的固定化研究除了傳統(tǒng)的固定化方法外，主要集中在定點固定化方面[16]。這種固定化酶的成本較高，不適宜應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域；而傳統(tǒng)的固定化方法又存在酶活性差，固定化程度弱等問題。本研究在傳統(tǒng)固定化方法的基礎(chǔ)上采用復(fù)合固定化[17]方法對異源表達的羧肽酶進行吸附-交聯(lián)復(fù)合固定化，以期對固定化的羧肽酶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及主要試劑 M00988菌株、OTA標品，Pribolab 生物工程有限公司；BL21（DE3）感受態(tài)細胞、DH5α感受態(tài)細胞，天根生化科技有限公司；真菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，OMEGA生物技術(shù)有限公司；S-8、AB-8、D4020、D201GF、D152 大孔樹脂，勤實科技有限公司；LA Taq酶，Takara生物工程有限公司；Nco1、Not1、T4連接酶，NEB生物工程有限公司。

1.1.2 主要儀器、設(shè)備 PCR儀，Biolab有限公司；高效液相色譜，Agilent有限公司；凝膠成像儀，GE有限公司；傅里葉變換紅外光譜，Thermo有限公司；低溫冷凍離心機，Beckman有限公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-cp 采用基因組提取試劑盒獲得菌株M00988基因組，依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中同源菌株設(shè)計引物：

Otase-F：gggAATTCATggTCCgCCgCCgAATTg

Otase-R：AAgCgggCgCCAgAAAAggATTACgTg

通過PCR獲得全長片段，PCR反應(yīng)體系：選擇 LA Taq酶，94℃預(yù)變性 5 min，94℃ 30 s，50℃1 min，72℃ 1 min，循環(huán) 30次，72℃ 10 min。 由PCR獲得羧肽酶全長基因（cp），經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化后連接PMD18-T，熱激導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選，并測序分析。在經(jīng)測序驗證的cp兩端引入Nco1和Not1的酶切位點，雙酶切cp及載體pET28a。酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后接體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-cp。

1.2.2 解毒能力測定 構(gòu)建1 mL反應(yīng)體系：OTA終質(zhì)量濃度為 1 μg/mL，加入 50 μL 重組酶，其余用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液補齊。將反應(yīng)體系在37℃下保溫1 h，采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測重組酶蛋白濃度，計算脫毒能力（式1）。

OTA采用高效液相色譜測定，反應(yīng)體系與70%甲醇水溶液 1∶1（V∶V）混合，過 0.22 μm 有機濾膜后完成樣品制備。HPLC測定OTA條件：進樣量 20 μL，流量 0.5 mL/min，流動相 V乙腈∶V水∶V乙酸=99∶99∶2，熒光檢測器激發(fā)波長 333 nm，發(fā)射波長460 nm。

1.2.3 重組羧肽酶的表達及誘導(dǎo)條件優(yōu)化 將連接體系導(dǎo)入BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，整理克隆子。將克隆子挑入kan抗性LB培養(yǎng)基中富集，待菌體濃度到達0.6～0.8時加入IPTG低溫誘導(dǎo)18 h。將菌液離心，去除培養(yǎng)基，加入pH7.5的磷酸鹽緩沖液進行超聲破壁，獲得粗酶液。對粗酶液進行脫毒試驗，測定OTA降解率（式2），確定重組酶活性。之后對IPTG濃度、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間及誘導(dǎo)溫度進行優(yōu)化：分別選擇 0.25，0.375，0.50，0.635，0.75 mmol/L作為IPTG終濃度，分別選擇16，20，24，28 ℃作為誘導(dǎo)溫度，分別選擇 12，16，20，24，28 h作為誘導(dǎo)時間，測定生長曲線確定誘導(dǎo)條件。

構(gòu)建1 mL粗酶液測定體系：OTA終質(zhì)量濃度為 1 μg/mL，加入 100 μL 粗酶液，其余用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液補齊。將反應(yīng)體系在37℃下保溫4 h，HPLC測定 OTA濃度，確定 OTA降解率（式2）。

式中：C——初始OTA的質(zhì)量濃度（μg/mL）；C0——脫毒反應(yīng)后樣品中OTA的質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.2.4 重組羧肽酶的純化 利用Pet28a載體上攜帶的His+標簽，采用鎳柱親和層析，pH7.5的磷酸鹽為平衡緩沖液，加入高咪唑濃度洗脫，得到電泳純的重組羧肽酶。

1.2.5 重組酶的固定化研究

1.2.5.1 固定化載體及活化方式的選擇 選擇5種具有代表性的大孔樹脂分別經(jīng)過酸堿浸泡和乙醇活化[18]，選擇 100 μL 上樣量，37℃、180 r/min 吸附8 h，0.25%戊二醛37℃交聯(lián)4 h為初始固定化條件，測定酶活回收率（式3）作為驗證指標。

表1 大孔樹脂種類Table1 The species of macroporous resin

1.2.5.2 固定化條件的優(yōu)化 對吸附溫度（20，25，30，35，40，45 ℃）、 吸附時間（3，6，9，12，15，18 h）、戊二醛質(zhì)量分數(shù)（0.05，0.15，0.25，0.35，0.45，0.55%）、交聯(lián)時間（1，2，3，4，5，6 h）、交聯(lián)溫度（4，16，25，37℃）進行單因素試驗設(shè)計，確定最終固定化條件。

1.2.5.3 固定化酶動力學(xué)參數(shù)測定 將重組酶與固定化酶分別置于不同OTA濃度下反應(yīng)并測定解毒能力。 根據(jù)米氏方程 V=Vmax×[S]/（Km+[S]），用雙倒數(shù)法作圖，即以酶促反應(yīng)的倒數(shù)1/V對底物濃度的倒數(shù)1/[S]作一直線，根據(jù)其斜率及截距求Km及Vmax，在1.2.4節(jié)條件下測定解毒能力。

1.2.5.4 固定化酶結(jié)構(gòu)的初步探究 采用紅外色譜測定重組酶和固定化酶的二級結(jié)構(gòu)，同時用SWISS-MODEL在線模擬羧肽酶三維結(jié)構(gòu)，初步探索固定化后重組酶二級結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-cp的構(gòu)建

采用引物Otase-F和Otase-R進行擴增，泳道1、2中為cp基因約1 500 bp左右的片段 （圖1a）。測序（華大測序公司）后，與NCBI上的模式片段進行比對，確定其氨基酸組成一致。比對質(zhì)粒和基因片段，選擇Not1和Nco1兩種限制性內(nèi)切酶，設(shè)計引物在片段兩端連接酶切位點并進行雙酶切，構(gòu)建pET28a-cp重組質(zhì)粒（圖1b）。

2.2 羧肽酶全長生物信息學(xué)分析

羧肽酶基因cp全長1 443 bp，GC含量53.85%，序列中無內(nèi)含子，編碼481aa，軟件預(yù)測編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為51.1 ku，等電點PI=6.24。經(jīng)信號肽預(yù)測，確定此序列無信號肽，如圖2所示。

圖1 質(zhì)粒pET28a-cp的構(gòu)建Fig.1 Construction of plasmid pET28a-cp

圖2 cp氨基酸序列Fig.2 The sequence of cp amino acid

將cp的氨基酸序列在信號肽的在線分析網(wǎng)站 http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 分析，結(jié)果如圖3所示，該段基因無信號肽，可直接進行原核表達。

經(jīng)PSIPRED預(yù)測氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)如圖4所示，藍色信號強弱為置信度，該序列共有14個α螺旋，14個β片層結(jié)構(gòu)，α螺旋與β片層結(jié)構(gòu)交替出現(xiàn)。

2.3 重組羧肽酶的表達及條件優(yōu)化

2.3.1 重組羧肽酶的表達 將重組片段導(dǎo)入BL21（DE3）感受態(tài)細胞后，進行初步誘導(dǎo)，超聲破壁獲得粗酶液，脫毒反應(yīng)確定OTA降解率為56%。

圖3 cp序列信號肽分析Fig.3 The analysis of signal peptide from cp sequence

圖4 cp二級結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Secondary structure of cp

2.3.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化 經(jīng)過單因素優(yōu)化，圖5所示，通過對生長曲線的測定發(fā)現(xiàn)，重組大腸桿菌在1～5 h間處于對數(shù)生長期，0～1 h處于調(diào)整期，約5 h后進入穩(wěn)定期。由《分子生物克隆指南》[19]可知，菌體處于對數(shù)中期為最佳誘導(dǎo)時期。研究表明：在菌體OD600值0.6～0.8時菌體處于對數(shù)中期，誘導(dǎo)效果最佳，因此選取培養(yǎng)2.5 h作為添加IPTG的誘導(dǎo)時機。在最佳誘導(dǎo)時機時加入IPTG，當(dāng)IPTG濃度為1.0 mmol/L時，原核表達的羧肽酶酶活較高，達49.2%；當(dāng)誘導(dǎo)溫度28℃時，原核表達的羧肽酶的脫毒效率約50%；當(dāng)誘導(dǎo)時間為20 h時，重組羧肽酶解毒效率最高，達97.1%。

圖5 原核表達條件優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Prokaryotic expression condition

綜上所述，最終優(yōu)化的最優(yōu)表達條件為培養(yǎng)2.5 h開始誘導(dǎo)，加入IPTG終濃度1.0 mmol/L，誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)時間20 h。條件優(yōu)化后重組羧肽酶降解OTA底物色譜圖如圖6所示，OTA目標峰在保留時間27min左右出峰。主要的酶降解產(chǎn)物OTα保留時間為10.5 min，試驗表明，OTα的毒性明顯小于OTA的毒性作用，相對比較安全[20]。

2.4 重組羧肽酶的純化

粗酶液經(jīng)鎳柱純化，SDS-PAGE檢測，得到電泳純的重組羧肽酶（圖7），酶分子約51 ku，與預(yù)測分子質(zhì)量基本一致。純化結(jié)果如表2所示。羧肽酶的解毒效果由解毒能力（μg/mg）來表示，即每μg重組酶降解OTA的能力。

圖6 高效液相色譜譜圖Fig.6 High performance liquid chromatogram

圖7 重組羧肽酶純化圖（a）及SDS-PAGE電泳圖（b）Fig.7 Purification system diagram （a） and SDS-PAGE electrophoresis figure （b）of recombinant carboxypeptidase AKTA

表2 原核表達重組羧肽酶的純化結(jié)果Table2 Purification results of recombinant carboxypeptidase for prokaryotic expression

2.5 重組羧肽酶的固定化

2.5.1 固定化載體的選擇及固定化條件的優(yōu)化固定化酶的固定效果由酶活回收率來表示。由圖8可知，5種大孔樹脂中，經(jīng)酒精活化的AB-8樹脂吸附酶蛋白的酶活回收率較高，選擇AB-8樹脂作為吸附載體。其中交聯(lián)時間和交聯(lián)溫度對固定化效果的影響較小，考慮到實際操作中的方便性和節(jié)約性，選擇交聯(lián)時間1 h、交聯(lián)溫度為室溫25℃，其余條件對固定化效果影響較顯著，選擇吸附溫度35℃、吸附時間12 h、戊二醛含量0.35%。

圖8 羧肽酶固定化條件優(yōu)化結(jié)果Fig.8 Optimization results of immobilized carboxypeptidase

2.5.2 固定化酶動力學(xué)參數(shù)變化 采用雙倒數(shù)法作圖，根據(jù)斜率與截距計算動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果為：重組酶 Km值為 0.67 μg/mL，Vmax為 111.1 μg/mg，Kcat值為18.52，該酶催化效率為27.64；固定化酶Km值為 11.50 μg/mL，Vmax為 97.09 μg/mg，Kcat值為324，固定化后酶的催化效率為28.17。由上述結(jié)果可看出，重組酶經(jīng)固定化后，酶對底物的親和力有所下降，而酶促反應(yīng)的Vmax并沒有顯著下降，固定化酶的催化效率沒有降低，表明對異源表達的羧肽酶進行吸附-交聯(lián)復(fù)合固定化效果良好。

圖9 重組酶（a）及固定化酶（b）雙倒數(shù)測定動力學(xué)參數(shù)Fig.9 Kinetic parameters of double enzyme-linked immunosorbent assay （a） enzyme and （b） immobilized enzyme

2.5.3 固定化對重組酶結(jié)構(gòu)的影響 將純化的重組羧肽酶經(jīng)紅外光譜分析檢測得到圖11，1 600～1 700 cm-1為與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的酰胺Ⅰ區(qū)，它是由肽骨架范圍內(nèi)C＝O伸縮振動所引起[21]。經(jīng)曲線擬合后得到重組酶二級結(jié)構(gòu)為α螺旋10.68%，β折疊40.68%，β轉(zhuǎn)角27.76%，無規(guī)則卷曲20.88%。經(jīng)固定化后，α螺旋17.51%，β折疊26.67%，β轉(zhuǎn)角29.93%，無規(guī)則卷曲25.89%。羧肽酶經(jīng)固定化后，α螺旋和無規(guī)則卷曲的含量有所上升，β折疊下降幅度較大，β轉(zhuǎn)角的百分含量變化不明顯。蛋白質(zhì)常見的二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋和β-折疊。其二級結(jié)構(gòu)是通過骨架上的羰基和酰胺基團之間形成的氫鍵維持的，氫鍵是穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的主要作用力。與在線模擬的三維結(jié)構(gòu) （圖11）對比后，推測羧肽酶二級結(jié)構(gòu)中部分相鄰肽鍵酰胺氫羰基氧間形成的鏈內(nèi)氫鍵部分斷裂后，轉(zhuǎn)變成為無規(guī)則結(jié)構(gòu)，同時部分β折疊的肽鍵酰胺氫與羰基氧間形成的鏈內(nèi)氫鍵在固定化過程中斷裂，重新與其它不同位置的羰基氧與酰胺氫形成新的鏈內(nèi)氫鍵，導(dǎo)致酶二級結(jié)構(gòu)中原來的β折疊部分轉(zhuǎn)變?yōu)棣谅菪Y(jié)構(gòu)[22]。模擬圖中位于N端虛線框內(nèi)的β片層結(jié)構(gòu)較為集中，當(dāng)氫鍵斷裂后，片層結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能導(dǎo)致酶對底物的親和能力較之前有所下降[23]。

圖10 傅里葉紅外檢測（a）重組羧肽酶出峰及（b）固定化酶擬合結(jié)果圖Fig.10 Fourier transform infrared detection of （a） recombinant carboxypeptidase peak and the curve fitting results of（b） immobilized enzyme

圖11 固定化后羧肽酶結(jié)構(gòu)變化模擬圖Fig.11 Simulated diagram of structural transformation of carboxypeptidase after immobilization

3 結(jié)論

黑曲霉源羧肽酶經(jīng)過原核表達，解決了天然酶酶量低且不易純化的缺點，并且誘導(dǎo)條件優(yōu)化后重組粗酶液的OTA降解率由50%提高至97.11%，效果顯著。重組羧肽酶的固定化條件優(yōu)化后，選擇AB-8大孔樹脂作為吸附載體，0.35%的戊二醛為交聯(lián)劑，酶活回收率在85%以上。通過對酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)以及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的研究，初步推斷吸附-交聯(lián)固定化對羧肽酶結(jié)構(gòu)的影響：酶經(jīng)固定化后，部分β折疊鏈內(nèi)氫鍵斷裂，轉(zhuǎn)變成為無規(guī)則結(jié)構(gòu)或α螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致固定化酶對底物的親和力較之前有所下降，而其Vmax與游離態(tài)酶基本保持一致，因此固定化酶與游離態(tài)酶的催化效率基本一致。