冀曉龍 韓 林 王曉琴 彭 強(qiáng) 王 敏

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100）

紅棗（Zizyphus jujuba Mil1.）又名大棗、刺棗、美棗、華棗等，是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物棗樹(shù)（Ziziphus Mill.）的果實(shí)。我國(guó)是世界上最大的棗生產(chǎn)國(guó)，據(jù)國(guó)家數(shù)據(jù)網(wǎng)統(tǒng)計(jì)2018年我國(guó)紅棗產(chǎn)量為852.20萬(wàn)t，棗產(chǎn)量占全世界的95%以上，在國(guó)際貿(mào)易市場(chǎng)中占據(jù)主導(dǎo)地位[1]。棗果的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且具有多種功效，是一種天然的藥食兩用食品。除基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及多種維生素、微量元素、有機(jī)酸等，紅棗中還含有糖類、皂甙類、萜酸類、黃酮類、腺苷類等多種功能性植化成分，而多糖已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[2-3]。紅棗富含多糖，多為中性多糖和酸性多糖，分子質(zhì)量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，研究證明紅棗多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、保肝、調(diào)節(jié)腸道菌群等活性[4-5]。

木棗（Zizyphus jujuba cv.Muzao）別名呂梁母棗，為鼠李科棗屬植物棗樹(shù)的果實(shí)，主要分布于山西省呂梁地區(qū)和陜西省榆林地區(qū)黃河沿岸，為當(dāng)?shù)刂髟云贩N[6]。然而，目前關(guān)于木棗多糖的報(bào)道較少。曹犇[7]通過(guò)小鼠游泳試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)木棗多糖能夠延緩小鼠運(yùn)動(dòng)后疲勞的產(chǎn)生，具有抗疲勞作用。王永杰等[8]對(duì)木棗多糖分離純化得到3個(gè)組分HJP1、HJP2和HJP3，而僅對(duì)HJP1和HJP3進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和抗腫瘤活性研究，未研究其抗腫瘤作用機(jī)制。為此，本研究采用水提、醇沉、脫蛋白和脫色等工藝提取木棗多糖，研究其對(duì)胃癌腫瘤細(xì)胞MKN-45的凋亡作用及其機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)木棗多糖在功能性食品上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木棗多糖（ZMP）為本課題組用熱水浸提、醇沉、脫蛋白和脫色工藝制得，其分子質(zhì)量為59.1 ku，由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，其物質(zhì)的量比為2.3∶19.7 ∶1.2 ∶1.0 ∶2.6 ∶8.3 ∶13.2[6]。

MKN-45（人低分化胃癌細(xì)胞系，Human poorly differentiated gastric cancer cell line），西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院曹斌云教授惠贈(zèng)。

DMEM高糖培養(yǎng)基，GIBCO公司；胰酶（Trypsin）、 二 甲 基 亞 砜 （DSMO）、LPS（ 批 號(hào)L2880）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 （MTT）、4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、丫啶橙（AO）、溴化乙啶（EB），Sigma 公司；BCA蛋白定量試劑盒、Western及IP細(xì)胞裂解液 （P0013），碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清（FBS），SeraPro公司；SOD超化物歧化酶檢測(cè)試劑盒、MDA細(xì)胞丙二醛測(cè)定試劑盒、LDH乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；硫酸鏈霉素（100萬(wàn)單位）和青霉素（80萬(wàn)單位），哈藥集團(tuán)制藥總廠；抗體：Bcl-2抗體、Bax抗體、cytochrome c抗體、caspase 3 抗體、cleaved caspase 3抗體、β-actin，碧云天生物技術(shù)公司；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)，美國(guó)熱電公司；潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；熒光電子顯微鏡，OLYMPUS IX71；實(shí)時(shí)定量?jī)x、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀，伯樂(lè)公司；酶標(biāo)儀，Bio-Rad 680；凝膠成像系統(tǒng)，北京生物技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡，西安測(cè)維光電技術(shù)有限公司；自動(dòng)滅菌鍋，西安海聯(lián)有限公司；液氮罐、-80℃冰箱，海爾集團(tuán)；凍存盒，天根生化科技有限公司；移液器，Eppendorf公司；烘箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MKN-45腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度37℃，CO25%，濕度5%。從液氮中拿出裝有腫瘤細(xì)胞的凍存管，置于37℃水浴使其快速融化，迅速將細(xì)胞液移至離心管中，1 000 r/min離心3 min，小心吸去離心管中的泡沫后棄上清液，加入1 mL DMEM高糖培養(yǎng)液，用移液器吹打均勻，將離心管中的細(xì)胞液重新移入預(yù)先添加3 mL培養(yǎng)液的3.5 cm培養(yǎng)皿中，混合均勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般將細(xì)胞被培養(yǎng)2代，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后即可用于試驗(yàn)。

1.3.2 木棗多糖對(duì)MKN-45細(xì)胞毒性測(cè)定 采用MTT比色法測(cè)定木棗多糖對(duì)MKN-45細(xì)胞毒性。將ZMP用培養(yǎng)液配成質(zhì)量濃度為 6.4 mg/mL，再用培養(yǎng)液將樣液進(jìn)一步1∶1 000稀釋。將96孔板內(nèi)的細(xì)胞液小心吸出后，依次加入樣液稀釋液，每孔200 μL，置培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h。設(shè)對(duì)照組（含細(xì)胞和培養(yǎng)液）、空白對(duì)照組（只含培養(yǎng)液）、陰性對(duì)照組（含DMSO的培養(yǎng)液，DMSO的含量小于1%），每組樣液設(shè)5個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次。加MTT溶液，孵育4 h，測(cè)定吸光度值。

ZMP對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率%=（OD對(duì)照組-OD試驗(yàn)組）/（OD對(duì)照組-OD空白）。

1.3.3 DAPI/AOEB染色 將細(xì)胞均勻地鋪板在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后將各孔細(xì)胞用相應(yīng)濃度的樣液處理24 h。收集細(xì)胞，PBS（pH 7.4）清洗3遍，每次2 min，收集細(xì)胞，用4%多聚甲醛在4℃固定15 min。接著用PBS清后，細(xì)胞經(jīng)過(guò)DAPI （1 μg/mL） 處理后在 37℃孵育 15 min，用PBS清洗，將細(xì)胞懸液滴加到載玻片上，在暗室觀察。

將細(xì)胞均勻地鋪板在6孔板中，細(xì)胞密度為105個(gè)/mL/孔。24 h后，每孔細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)濃度的樣液處理，繼續(xù)孵育24 h。清洗細(xì)胞后，用10 μL AO/EB溶液直接孵育30 s，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 測(cè)定細(xì)胞中SOD活性和MDA含量 實(shí)驗(yàn)處理后棄培養(yǎng)基，各組腫瘤細(xì)胞用PBS洗滌2遍，胰酶消化后，離心沉淀，收集細(xì)胞，加入300 μL裂解液，在4℃放置30 min后，冷凍離心，收集上清液，按SOD和MDA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量。

1.3.5 測(cè)定細(xì)胞組織中LDH活性 實(shí)驗(yàn)處理后立即取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清500 μL，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定腫瘤細(xì)胞組織中的LDH含量。

1.3.6 Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase-3 蛋白表達(dá)量測(cè)定[9]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/mL/皿，加入不同濃度ZMP樣液培養(yǎng)24 h。根據(jù)蛋白提取試劑盒操作說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總蛋白，將細(xì)胞的蛋白樣液定量、變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用脫脂牛奶封閉2 h，洗膜，加入 Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase-3（稀釋倍數(shù)1 ∶1 ∶000）的一抗，以 β-actin （稀釋倍數(shù) 1∶1 000）作為陽(yáng)性對(duì)照，4℃過(guò)夜。加入稀釋好的二抗，室溫孵育1 h，然后洗膜、風(fēng)干，使用ChemiBox凝膠成像系統(tǒng)對(duì)蛋白膜進(jìn)行曝光。使用Quantity one 4.6.2軟件對(duì)得到的蛋白條帶進(jìn)行條帶灰度分析。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2007和SPSS 20.0對(duì)各測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行比較分析，采用單因素方差分析One-way ANOVA檢驗(yàn)方差齊性，并用Student’s-t分析。*P<0.05表示有顯著性差異。所有結(jié)果均用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 木棗多糖對(duì)MKN-45細(xì)胞毒力測(cè)定

如圖1所示，用不同質(zhì)量濃度的ZMP樣液（0，50，100，200，400，800，1 600，3 200，6 400 μg/mL）分別處理MKN-45腫瘤細(xì)胞24 h和48 h，在ZMP濃度和培養(yǎng)時(shí)間相應(yīng)增加后，MKN-45細(xì)胞的存活率明顯下降，呈劑量依賴性。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)6 400 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)24 h的ZMP對(duì)癌細(xì)胞抑制率達(dá)74.28%，48 h后達(dá)77.29%，與巢蕾等[10]用5-FU對(duì)MKN-45細(xì)胞做陽(yáng)性對(duì)照相比，抑制效果顯著（P<0.01）。根據(jù)對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒力測(cè)定，選擇ZMP 質(zhì)量濃度為 1 600，3 200 μg/mL 和 6 400 μg/mL，處理24 h來(lái)研究其對(duì)MKN-45細(xì)胞蛋白酶活力及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

2.2 DAPI染色結(jié)果

圖1 ZMP對(duì)MKN-45細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of ZMP on the macrophages viability of MKN-45

根據(jù) MTT試驗(yàn)結(jié)果，用0，3 200 μg/mL的ZMP樣液處理MKN-45細(xì)胞，染色觀察發(fā)現(xiàn)，圖2中空白對(duì)照樣液（Control）的細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色核，而樣液 ZMP 處理組（圖 2 中 1，2，3）的細(xì)胞核的形態(tài)變小，細(xì)胞核的顏色亮，并有星狀或者點(diǎn)狀的亮藍(lán)色凝聚，這主要是由細(xì)胞核和染色體凝聚，細(xì)胞核碎片和凋亡小體產(chǎn)生。試驗(yàn)結(jié)果表明，3 200 μg/mL ZMP對(duì)MKN-45細(xì)胞凋亡起誘導(dǎo)作用。

圖2 MKN-45細(xì)胞DAPI染色圖（400×）Fig.2 Morphological changes in MKN-45 cells by DAPI staining （400×）

2.3 AOEB染色結(jié)果

根據(jù)MTT試驗(yàn)結(jié)果，選取不同的濃度ZMP樣液處理MKN-45細(xì)胞，染色發(fā)現(xiàn)，圖3中空白對(duì)照樣液（Control）的腫瘤細(xì)胞形態(tài)呈完整的梭狀，核呈均勻的熒光綠，當(dāng)ZMP樣液質(zhì)量濃度為1600 μg/mL時(shí)，細(xì)胞核出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的早期現(xiàn)象，細(xì)胞核固縮，變?yōu)辄S綠色，這可能是由于細(xì)胞膜滲透性改變，細(xì)胞核和染色質(zhì)凝聚的結(jié)果 （圖3A）。當(dāng)ZMP樣液質(zhì)量濃度為6 400 μg/mL時(shí)，部分細(xì)胞皺縮為橘紅色，出現(xiàn)晚期凋亡的特征（圖3B）。

2.4 ZMP對(duì)腫瘤細(xì)胞中SOD含量的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的細(xì)胞內(nèi)自由基清除劑，它能夠防御由ROS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激而造成的細(xì)胞損傷[11]。多糖是一種重要的生物活性成分，ZMP可以刺激MKN-45細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)SOD活力，使其不能及時(shí)發(fā)揮抗氧化作用，從而受到氧自由基的攻擊，引起細(xì)胞的損傷和凋亡。

如圖4所示，隨著ZMP濃度的增加，細(xì)胞中SOD活力下降，呈濃度依賴性。在樣液質(zhì)量濃度分別為 0，1 600，3 200 μg/mL 和 6 400 μg/mL 時(shí)，其對(duì)MKN-45細(xì)胞的SOD活力分別為22.31，20.92，15.91 nmol/mg蛋白和3.10 U/mg蛋白。與對(duì)照組相比，ZMP質(zhì)量濃度為6 400 μg/mL時(shí)，細(xì)胞SOD活力明顯下降，這可能會(huì)引發(fā)因氧自由基攻擊而產(chǎn)生的癌細(xì)胞凋亡。

2.5 ZMP對(duì)腫瘤細(xì)胞中MDA含量的影響

丙二醛（MDA）是膜相關(guān)的脂質(zhì)過(guò)氧化降解的產(chǎn)物，是細(xì)胞膜氧化損傷的指標(biāo)。如圖5所示，隨著ZMP濃度的增加，細(xì)胞中MDA的活力明顯升高，且呈濃度依賴性，在ZMP樣液質(zhì)量濃度分別為 0，1 600，3 200 μg/mL 和 6 400 μg/mL 時(shí)，其對(duì)MKN-45 細(xì) 胞 的 活 力 分 別 為 7.41，10.61，25.86 nmol/mg蛋白和47.33 nmol/mg蛋白。與對(duì)照組相比，ZMP對(duì)MKN-45細(xì)胞的MDA含量影響顯著，隨著ZMP濃度的增加，細(xì)胞膜氧化損傷加劇，細(xì)胞凋亡更明顯。

圖3 MKN-45細(xì)胞AOEB染色圖（400×）Fig.3 Morphological changes in MKN-45 cells by AOEB staining （400×）

圖4 ZMP對(duì)MKN-45細(xì)胞的SOD活力的影響Fig.4 The effect of ZMP on SOD activity in MKN-45 cells

圖5 ZMP對(duì)MKN-45細(xì)胞的MDA含量的影響Fig.5 The effect of ZMP on MDA content in MKN-45 cells

2.6 ZMP對(duì)腫瘤細(xì)胞中LDH含量的影響

乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量是細(xì)胞膜完整性以及氧化負(fù)擔(dān)引起的細(xì)胞壞死的一個(gè)重要指標(biāo)。隨著細(xì)胞的凋亡，LDH含量增加，凋亡明顯。如圖6所示，隨著ZMP濃度的增加，細(xì)胞中LDH的活力明顯增強(qiáng)，且呈濃度依賴性。在樣液質(zhì)量濃度分別 為 0，1 600，3 200 μg/mL 和 6 400 μg/mL 時(shí) ，ZMP對(duì)MKN-45細(xì)胞的LDH活力分別為548.77，880.35，912.78和1 165.19。與對(duì)照組相比，在試驗(yàn)濃度范圍，ZMP對(duì)MKN-45細(xì)胞的LDH活力雖有增強(qiáng)趨勢(shì)但不顯著，表明隨著ZMP濃度的升高，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)一定的凋亡趨勢(shì)。

圖6 ZMP對(duì)MKN-45細(xì)胞的LDH含量的影響Fig.6 The effect of ZMP on LDH content in MKN-45 cells

2.7 Western blot驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞凋亡通路

根據(jù)MKN-45細(xì)胞毒性試驗(yàn)及細(xì)胞染色試驗(yàn)結(jié)果，ZMP可引起胃癌細(xì)胞MKN-45凋亡。為進(jìn)一步研究ZMP誘導(dǎo)細(xì)胞MKN-45可能的凋亡機(jī)制，采用Western blot技術(shù)研究抗凋亡蛋白（Bcl-2）和促凋亡蛋白（Bax，Cyt-c 和 Caspase-3）的表達(dá)。

如圖7所示，在ZMP質(zhì)量濃度為1 600，3 200 μg/mL和6 400 μg/mL時(shí)，ZMP可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)促凋亡蛋白Bax，Cyt-c和Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)Cyt-c從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)中。與對(duì)照組相比，Bcl-2蛋白和Bax蛋白的比值在ZMP的質(zhì)量濃度為3 200 μg/mL時(shí)，明顯下降。隨著ZMP濃度的升高，活化的Cleavedcaspase-3與Caspase-3蛋白表達(dá)的比值明顯升高。與對(duì)照組相比，Cyt-c的釋放量增加趨勢(shì)不顯著。

圖7 ZMP對(duì)Bcl-2家族，Caspase 3以及Cyt-c蛋白表達(dá)的影響Fig.7 The effect of ZMP on protein expressions of Bcl-2 family，Caspase 3 and Cyt-c

2.8 討論

細(xì)胞凋亡常常伴隨著各種相關(guān)凋亡通路的激活，包括Caspases，基因表達(dá)改變，線粒體紊亂以及ATP消耗[12]。雖然信號(hào)在細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，但二級(jí)氧化產(chǎn)物的積累引起的細(xì)胞凋亡也是不可忽視的，尤其是細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平[11]。機(jī)體內(nèi)SOD水平與細(xì)胞氧化還原相關(guān)，也是細(xì)胞內(nèi)自由基清除效果的指示酶。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的二級(jí)代謝產(chǎn)物，代表體內(nèi)脂肪氧化水平。LDH的過(guò)度積累會(huì)引起細(xì)胞損傷。以木棗多糖刺激MKN-45細(xì)胞，檢測(cè)到MKN-45細(xì)胞的SOD水平下降，MDA和LDH水平升高，說(shuō)明木棗多糖可通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)SOD水平，提高M(jìn)DA水平來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Caspase-3是細(xì)胞線粒體凋亡通路中非常關(guān)鍵的蛋白[13-14]?？沟蛲龇肿尤鏐cl-2可阻斷Cyt-c的釋放，從而中止細(xì)胞凋亡的聯(lián)級(jí)反應(yīng)；相反，促凋亡蛋白Bax，則可以促進(jìn)Cyt-c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，活化Caspase-9，Caspase-3，進(jìn)而引起 DNA斷裂，細(xì)胞形態(tài)和生物化學(xué)改變以致凋亡[15]。經(jīng)ZMP處理，可減少M(fèi)KN-45細(xì)胞的Bcl-2/Bax表達(dá)，增加Cyt-c和Caspase-3表達(dá)，表明ZMP可能通過(guò)線粒體內(nèi)源途徑介導(dǎo)MKN-45細(xì)胞凋亡 （如圖8所示）。

圖8 木棗多糖通過(guò)線粒體內(nèi)源途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MKN-45凋亡Fig.8 Possible schematic representations of mechanisms involved in the activation of apoptotic signaling pathway in MKN-45 cell by ZMP

3 結(jié)論

本研究表明：木棗多糖具有顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并隨著濃度的升高，細(xì)胞凋亡程度增強(qiáng)；其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與減弱SOD的活性，增加MD和LDH含量有關(guān)。木棗多糖可下調(diào)腫瘤細(xì)胞中Bcl-2/Bax的蛋白表達(dá)，上調(diào)Cyt-c和Cleaved caspase-3/Caspase-3的蛋白表達(dá)，木棗多糖可能通過(guò)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MKN-45凋亡。