楊 麗，王向陽(yáng)，徐曉平，陳 哲，朱洪怡，霍繼榮

1.湖南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410005； 2.長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院老年科； 3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院消化內(nèi)科

肝小靜脈閉塞病(hepatic veno-occlusive disease，HVOD)又稱肝竇阻塞綜合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS)[1]。臨床報(bào)道我國(guó)服用土三七致HVOD有增多趨勢(shì)，HVOD發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療措施有限。本實(shí)驗(yàn)利用丹參干預(yù)土三七誘導(dǎo)的小鼠HVOD模型，研究HVOD發(fā)病機(jī)制并為HVOD治療提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性清潔級(jí)健康昆明小鼠(18～22 g)100只(由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)，隨機(jī)分為4組：A組(PBS對(duì)照組10只)；B組(土三七模型組30只)；C組(100 mg/kg丹參干預(yù)組30只)；D組(200 mg/kg丹參干預(yù)組30只)。各組動(dòng)物體質(zhì)量相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 試劑及儀器PBS由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，土三七購(gòu)自安徽省毫州市藥材鑒定公司中藥公司，丹參購(gòu)自哈藥集團(tuán)二產(chǎn),VEGF一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法A組PBS 25 ml/kg灌胃；B組將100 g土三七熬成藥液，相當(dāng)于生藥1 g/ml，30 ml/kg灌胃；C、D組將丹參粉針劑溶于質(zhì)量濃度為9 g/L的生理鹽水溶液，分別予100 mg/kg丹參+30 ml/kg土三七、200 mg/kg丹參+30 mg/kg土三七灌胃。各組小鼠連續(xù)灌胃30 d后處死。將新鮮肝臟取肝左葉4%甲醛固定，石蠟包埋，其余肝組織迅速標(biāo)本放入液氮保存。

1.4 組織學(xué)檢查新鮮肝臟組織4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，行HE染色和Masson trichrome染色。肝臟病理光鏡下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Deleve修改后[2-3]光鏡評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，包括中央靜脈(CV)內(nèi)皮損傷、肝細(xì)胞凝固性壞死、中央靜脈內(nèi)皮下出血、肝竇出血、中央靜脈內(nèi)皮下纖維化和中央靜脈外膜纖維化共6項(xiàng)。各項(xiàng)根據(jù)累及范圍、程度不同分別計(jì)分0～3分，累計(jì)各項(xiàng)計(jì)分，分為輕度(1～5分)、中度(6～8分)、重度(9～18分)。

1.5 免疫組化石蠟包埋組織，4 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。3% H2O2封閉，再用質(zhì)量濃度為50 g/L的牛血清白蛋白封閉，室溫放置20 min后加一抗(VEGF兔多克隆抗體，Abcam公司，美國(guó))40 μl，PBS稀釋(VEGF 1∶1 000)，置于濕盒中4 ℃冰箱過(guò)夜，37 ℃恢復(fù)30 min。再加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔二抗(碧云天，中國(guó))50 μl，置于濕盒中37 ℃ 30 min。DAB顯色試劑盒對(duì)各組進(jìn)行顯色，步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。染色結(jié)果判定：陽(yáng)性結(jié)果判定：細(xì)胞胞漿或間質(zhì)染成棕黃色，根據(jù)顏色的深淺，其陽(yáng)性程度大致分為弱和強(qiáng)兩個(gè)等級(jí)。各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取3個(gè)或4個(gè)標(biāo)本，顯微鏡下隨機(jī)攝片10張，以圖像分析軟件IPP6.0(Image-Pro Plus 6.0)進(jìn)行定量分析，所得累積光密度(integrated option density，IOD)的平均值即為該組小鼠的值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Lg(IOD)值表示。

1.6 RT-PCR檢測(cè)

1.6.1 引物設(shè)計(jì)：引物序列根據(jù)電腦軟件Prmier 5.0版設(shè)計(jì)。上游序列：5′-GACCCTGGCTTTACTGCTGTA-3′,下游序列：5′-GTGAGGTTTGATCCGCATGAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為303 bp。β-actin：上游序列:5′-ATGGATGACGATATCGCT-3′，下游序列:5′-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為568 bp。

1.6.2 RNA提取和cDNA合成：取肝組織用Trizol法提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)28 s、18 s、5 s 3條帶，無(wú)DNA污染條帶，無(wú)明顯降解條帶，表明提取的總RNA純度較高。取總RNA 1 μg，用逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成，-20 ℃保存。

1.6.3 目的基因的擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增全序列，PCR反應(yīng)條件：VEGF：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃共延伸7 min。β-actin：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃共延伸7 min。將反應(yīng)產(chǎn)物取5 μl經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，紫外透射儀下觀察結(jié)果，并在凝膠成像儀上照相。

2 結(jié)果

2.1 成模情況及病理組織學(xué)評(píng)分造模期間各組小鼠均有死亡現(xiàn)象，對(duì)照組死亡1只，土三七組死亡5只，100 mg/kg丹參干預(yù)組死亡4只，丹參200 mg/kg干預(yù)組死亡2只。對(duì)照組：根據(jù)HVOD診斷標(biāo)準(zhǔn)(Seattle標(biāo)準(zhǔn)[4]和Baltimore標(biāo)準(zhǔn)[5])和病理組織學(xué)檢查，病理學(xué)評(píng)分平均值為0.10，無(wú)小鼠可診斷為HVOD。土三七組：根據(jù)HVOD診斷標(biāo)準(zhǔn)和病理組織學(xué)檢查，土三七組有24只診斷為HVOD，其中5只出現(xiàn)大量腹水，根據(jù)Deleve修改后評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，病理學(xué)評(píng)分平均值為7.75，成模小鼠中25.0%(6/24)為輕度，45.8%(11/24)為中度，29.2%(7/24)為重度。100 mg/kg丹參干預(yù)組：仍有8只成模，未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)腹水。根據(jù)Deleve修改后標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，成模小鼠中37.5%(3/8)為輕度，50.0%(4/8)為中度，12.5%(1/8)為重度。200 mg/kg丹參干預(yù)組：僅3只成模，未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)腹水。根據(jù)Deleve修改后標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，成模的3只小鼠中33.3%(1/3)為輕度，66.7%(2/3)為中度，無(wú)重度HVOD小鼠(見(jiàn)表1～2)。

表1 各組小鼠成模情況 Tab 1 Model establishment in each group

表2 各組小鼠病理學(xué)評(píng)分 Tab 2 Scoring of pathology in each group

2.2 免疫組化VEGF表達(dá)VEGF在PBS組肝臟組織細(xì)胞和血管周圍基本不表達(dá)。土三七組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝組織細(xì)胞胞漿VEGF表達(dá)增多，幾乎整個(gè)肝小葉均有表達(dá)。肝竇周圍細(xì)胞胞漿表達(dá)最明顯，中央靜脈區(qū)相對(duì)較少。100 mg/kg丹參干預(yù)組肝竇周圍細(xì)胞胞漿中VEGF表達(dá)明顯增加，與土三七組比較，VEGF表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。200 mg/kg丹參干預(yù)組見(jiàn)散在的細(xì)胞胞漿VEGF表達(dá)，主要分布在肝竇周圍細(xì)胞，與土三七組和100 mg/kg丹參組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖1、表3)。

圖1 免疫組化VEGF表達(dá)(100×) A：PBS組；B：土三七組；C：100 mg/kg丹參組；D：200 mg/kg丹參組Fig 1 Immunohistochemical of VEGF expression (100×) A: PBS group; B: gynura segetum group; C: 100 mg/kg Salvia miltiorrhiza group; D: 200 mg/kg Salvia miltiorrhiza group

表3 各組小鼠VEGF免疫組化染色結(jié)果 Tab 3 Immunohistochemical of VEGF expression in each group

注：與PBS組比較，★P<0.01；與土三七模型組比較，☆P<0.01；與100 mg/kg丹參組比較，▲P<0.01。

2.3 肝組織VEGF mRNA的表達(dá)PBS組小鼠VEGF mRNA處于較低水平表達(dá)，土三七組小鼠VEGF mRNA處于較高水平表達(dá)；100 mg/kg丹參組小鼠肝組織VEGF mRNA表達(dá)較土三七組下降明顯，200 mg/kg丹參組VEGF mRNA表達(dá)與土三七模型組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖2、表4)。

注：M：mark；A：PBS組；B：土三七模型組；C：100 mg/kg丹參組；D： 200 mg/kg丹參組。

分組例數(shù)OD值PBS組40.738±0.015土三七模型組40.885±0.030★100 mg/kg丹參組40.823±0.025★☆200 mg/kg丹參組3 0.778±0.012★☆▲

注：與PBS組比較，★P<0.05；與土三七模型組比較，☆P<0.05；與100 mg/kg丹參組比較，▲P<0.05。

3 討論

HVOD是指肝小葉中央靜脈和小葉下靜脈損傷導(dǎo)致非血栓性管腔狹窄或閉塞而產(chǎn)生的肝內(nèi)竇后性門脈高壓癥。臨床表現(xiàn)為肝大、右上腹痛、腹水、黃疸[1]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞首先受到損傷又命名為HSOS[6]。HVOD近年來(lái)臨床報(bào)道有增多趨勢(shì)，在國(guó)內(nèi)土三七致HVOD報(bào)道多見(jiàn)。

丹參中提取的化學(xué)成分有脂溶性的丹參酮和水溶性成分如原兒茶醛、丹參素等。丹參的作用研究主要集中在改善心、肝、肺的缺血再灌注損傷、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和抗感染方面。我們課題組前期實(shí)驗(yàn)用土三七成功誘導(dǎo)HVOD模型的建立[3]，并證實(shí)丹參通過(guò)減輕肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷及肝竇纖維化等可預(yù)防HVOD發(fā)生[7]，丹參對(duì)HVOD的具體作用機(jī)制尚不清楚。

VEGF也稱血管通透因子，是一種能特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子。IGUCHI等[8]報(bào)道HVOD患者VEGF表達(dá)升高；VEGF誘導(dǎo)血管收縮、新生血管形成及凝血組織在單核細(xì)胞中表達(dá)可能是HVOD發(fā)生的機(jī)制[9]；NAKAMURA等[10]提出抑制血管新生可以預(yù)防HVOD。本研究免疫組織化學(xué)染色證實(shí)土三七組VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞廣泛表達(dá)，土三七組VEGF mRNA表達(dá)較PBS組明顯升高。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重度HVOD小鼠臨床表現(xiàn)為一般情況差，食量減少明顯，毛發(fā)無(wú)光澤，大量腹水，病理組織學(xué)改變Deleve修改后評(píng)分高，VEGF在核酸水平及蛋白水平表達(dá)均增加，提示VEGF表達(dá)水平與HVOD病情嚴(yán)重程度相關(guān)，由此推測(cè)VEGF表達(dá)水平可作為HVOD病情程度的重要指標(biāo)。100 mg/kg丹參組VEGF mRNA水平表達(dá)較土三七組低。200 mg/kg丹參組VEGF表達(dá)較少，mRNA水平較土三七模型組和100 mg/kg丹參組均明顯降低，說(shuō)明丹參可抑制VEGF表達(dá)，抑制VEGF表達(dá)可減少HVOD的發(fā)生。200 mg/kg丹參組較100 mg/kg丹參組對(duì)VEGF抑制作用更明顯，由此推測(cè)丹參對(duì)VEGF的抑制作用可能存在劑量依賴性。

綜上所述，VEGF在HVOD發(fā)生中起重要作用，丹參對(duì)預(yù)防HVOD的發(fā)生可能與抑制VEGF的表達(dá)有關(guān)。