楊煥玲　查磊　趙妍　黃建春　雋加香　陳明杰

摘要：以香菇菌株18為材料，通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)基的香菇菌絲生長(zhǎng)狀況的評(píng)價(jià)、菌絲生長(zhǎng)速度及生物量的分析，以篩選出新型的香菇母種培養(yǎng)基。結(jié)果表明，與基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基相比，添加海藻糖的新型培養(yǎng)基對(duì)香菇菌絲的生長(zhǎng)具有一定的積極作用，能夠促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)速度，有助于菌絲生物量的增加，但不改變其蛋白質(zhì)組成。綜合來(lái)看，PDTA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖10 g，海藻糖10 g，蒸餾水1 000 mL）、PTA-2培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，海藻糖20 g，蒸餾水1 000 mL）更適合香菇18菌絲的培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：香菇;培養(yǎng)基;生長(zhǎng)速度;生物量;SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）

中圖分類號(hào)： S646.1+20.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0124-03

香菇（Lentinula edodes）在分類學(xué)上屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 、傘菌綱（Agaricomycetes） 、傘菌目（Agaricales） 、光茸菌科（Omphalotaceae）、香菇屬（Lentinula）（Available online：http：//www.mycobank.org/）。香菇味道鮮美，肉質(zhì)細(xì)嫩，具有獨(dú)特的香氣和豐富的營(yíng)養(yǎng)，含有較高的蛋白質(zhì)、維生素以及多種類型的礦質(zhì)元素，有著山珍、菇中之王等美稱[1-2]。香菇具有延緩衰老、防癌抗癌、降血脂血壓及膽固醇、提高機(jī)體免疫功能等作用[3]，因此香菇具有很高的食用價(jià)值，市場(chǎng)廣闊，是世界上第二大食用菌，提高其產(chǎn)量及品質(zhì)具有重要意義[4]。

食用菌的培養(yǎng)基是保藏菌種的關(guān)鍵，同時(shí)也是生產(chǎn)上獲得高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要前提[5-6]。目前，香菇常使用的固體培養(yǎng)基主要為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）[7]，同時(shí)也存在其他少數(shù)類型的培養(yǎng)基，例如用農(nóng)副產(chǎn)品或金銀花藤浸出液制作的香菇母種培養(yǎng)基[8-9]，富硒香菇液體培養(yǎng)基[10-11]，產(chǎn)多糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)基[12]，碳源、氮源等優(yōu)化的香菇培養(yǎng)基[13-14]等。海藻糖是一種非還原性二糖，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，能夠增強(qiáng)生物體對(duì)高溫、脫水、干旱、冷凍、高滲透性、重金屬及有毒試劑等逆境的抵抗能力[15]。通過(guò)外源添加的方式，海藻糖在菌體外部形成保護(hù)膜，能起到較好的非特異性保護(hù)細(xì)胞，使生物膜和蛋白質(zhì)等在不良環(huán)境中免受傷害，并且使菌體不受自身代謝產(chǎn)物影響的作用[16-17]。本試驗(yàn)采用添加海藻糖的培養(yǎng)基，對(duì)香菇18菌株進(jìn)行培養(yǎng)，將它與常用的基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基進(jìn)行比較，篩選最佳培養(yǎng)基，不僅豐富了生產(chǎn)上的培養(yǎng)基種類，也在菌種保藏、交替使用培養(yǎng)基防止菌種退化及菌種抗逆等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香菇菌株18由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基種類

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水 1 000 mL。

PDTA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖10 g，海藻糖10 g，蒸餾水1 000 mL。

PDTA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，海藻糖 10 g，蒸餾水1 000 mL。

PTA-2固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，海藻糖 20 g，蒸餾水1 000 mL。

PTA-2液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，海藻糖20 g，蒸餾水 1 000 mL。

PTA-5固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，海藻糖 50 g，蒸餾水1 000 mL。

PTA-5液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，海藻糖50 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.3 固體及液體培養(yǎng)方法

所有培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min，冷卻后待接種。在紫外線滅菌30 min后的超凈工作臺(tái)上，選用相同生長(zhǎng)狀況的香菇菌絲進(jìn)行接種。固體培養(yǎng)在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，液體培養(yǎng)在25 ℃、150 r/min轉(zhuǎn)速的恒溫?fù)u床中黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 香菇菌絲生長(zhǎng)情況及蛋白組成的測(cè)定

1.4.1 菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)及生長(zhǎng)速度的測(cè)定 在長(zhǎng)滿菌絲的PDA固體培養(yǎng)基上，分別用直徑為5 mm的打孔器沿菌落邊緣打孔，將菌塊接種于不同類型的固體培養(yǎng)基上，在25 ℃黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察菌絲的生長(zhǎng)形態(tài)[18]。分別在接種后培養(yǎng)4、6、8 d用十字交叉法測(cè)量菌落半徑，菌落半徑差值（mm）與生長(zhǎng)時(shí)間（d）的比值即為菌絲生長(zhǎng)速度（mm/d）。每組重復(fù)3次，計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度并且在培養(yǎng)10 d時(shí)對(duì)菌絲菌落形態(tài)進(jìn)行拍照。

1.4.2 菌絲生物量的測(cè)定 接種后的液體培養(yǎng)基在25 ℃恒溫?fù)u床中黑暗條件下培養(yǎng)到10 d時(shí)，菌絲基本長(zhǎng)滿搖瓶，處于生長(zhǎng)旺盛階段，10 d時(shí)收集香菇菌絲。用烘干至恒質(zhì)量（m1）的濾紙過(guò)濾，將菌絲體與濾紙共同烘干至恒質(zhì)量（m2），計(jì)算菌絲體干質(zhì)量m=m2-m1，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.4.3 SDS-PAGE電泳分析 將在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d的菌絲進(jìn)行收集，采用TCA（三氯乙酸）/丙酮法提取蛋白質(zhì)，并用濃度為12.5%的凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析蛋白質(zhì)組成。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 不同培養(yǎng)基對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)狀況的影響? 將接種后的培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)，分別在接種后4、6、8、10 d比較觀察菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄菌絲色澤、邊緣整齊度以及菌落長(zhǎng)勢(shì)，并劃分如下長(zhǎng)勢(shì)等級(jí)：菌絲潔白粗壯，菌落濃密，菌絲分支多且密，長(zhǎng)勢(shì)好，邊緣整齊則標(biāo)記為+ + +;菌絲中等粗壯，菌落濃密，微黃，菌絲分支中等，邊緣較整齊記為+ +;菌絲纖細(xì)絨毛狀，微黃至黃褐色，菌落稀疏，邊緣不整齊則記為+[19]。

香菇在4種培養(yǎng)基上10 d的生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖1，菌絲生長(zhǎng)狀況評(píng)價(jià)見(jiàn)表1。香菇菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況良好，菌絲潔白微黃，菌落較稀疏，菌絲中等粗壯且分支中等，邊緣整齊;在PDTA培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好，菌絲潔白微黃，菌絲中等粗壯且菌落較濃密，菌落邊緣整齊;在PTA-2培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲潔白粗壯，菌落濃密，菌絲分支多且密，邊緣整齊;在PTA-5培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好，菌絲潔白微黃，菌落較濃密，菌絲分叉多，邊緣整齊。

2.1.2 不同培養(yǎng)基對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)速度的影響 香菇在不同的培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定結(jié)果（圖2）表明，添加海藻糖的培養(yǎng)基對(duì)菌絲的生長(zhǎng)速度具有不同程度的提高作用。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基PDA為對(duì)照，添加海藻糖的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度與對(duì)照具有顯著性差異，其中PDTA培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度與對(duì)照具有極顯著性差異。

2.1.3 不同培養(yǎng)基對(duì)香菇菌絲生物量的影響 香菇在不同液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌絲生物量測(cè)定結(jié)果（圖3）表明，添加海藻糖的培養(yǎng)基對(duì)菌絲生物量具有不同程度的提高作用。與對(duì)照相比，香菇在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的生物量均有一定程

度提高，但均未達(dá)到顯著性差異。

2.1.4 SDS-PAGE電泳 收集不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的香菇菌絲，采用TCA/丙酮法提取蛋白質(zhì)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果（圖4）表明，新培養(yǎng)基的菌絲蛋白質(zhì)條帶組成與基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲蛋白質(zhì)條帶組成無(wú)區(qū)別， 說(shuō)明添加海藻糖的培養(yǎng)基并不會(huì)改變香菇菌絲的蛋白質(zhì)組成。

3 討論與結(jié)論

香菇新型母種培養(yǎng)基的篩選對(duì)香菇菌種的保藏以及生產(chǎn)上高產(chǎn)的穩(wěn)定性具有重要影響。添加海藻糖的培養(yǎng)基能為香菇菌絲生長(zhǎng)提供良好的營(yíng)養(yǎng)和空間環(huán)境，且制作方法簡(jiǎn)單，能夠顯著加快菌絲的生長(zhǎng)，一定程度上提高菌絲生物量，具有間接增加經(jīng)濟(jì)效益的潛力。海藻糖作為一種穩(wěn)定的非還原性二糖，具有防止蛋白質(zhì)變性[20]的作用，而且積累到一定的水平，會(huì)響應(yīng)于高溫[21-22]、碳和氮饑餓[23-25]、氧自由基[26]、脫水[27-28]、冷脅迫[29]、冷凍[28]、甲苯及乙醇[30] 等引發(fā)的脅迫性應(yīng)激[20，31-32]。添加海藻糖培養(yǎng)基的使用，不但能夠?yàn)橄愎骄z提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，而且有助于增強(qiáng)香菇菌絲在培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)對(duì)脅迫條件的能力。試驗(yàn)以普通PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，對(duì)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的香菇菌絲生長(zhǎng)狀況進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度及生物量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，香菇菌絲較適合在PDTA培養(yǎng)基、PTA-2培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。綜上，本試驗(yàn)中香菇新型母種培養(yǎng)基可以為深入開(kāi)展食用菌菌種保藏技術(shù)提供參考，同時(shí)也揭示了外源添加海藻糖的培養(yǎng)基具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。

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