宋廣忠　萬雙雙　周茜　華玉鳳　楊珺

【摘 要】目的：探討miR-423-5p在Con A誘導的小鼠急性肝衰竭模型中的功能。方法：制備Con A誘導的小鼠急性肝衰竭模型。RT-qPCR檢測0 h， 6 h， 12 h， 24 h小鼠肝組織和血清中miR-423-5p 的表達情況，HE染色觀察肝組織病理學改變，全自動生化分析儀檢測血清 ALT和AST。結(jié)果：小鼠肝組織和血清miR-423-5p表達水平隨著肝衰竭進程顯著性升高。小鼠肝組織和血清miR-423-5p表達水平與肝細胞壞死率、血清ALT、AST水平呈顯著性正相關(guān)。結(jié)論：miR-423-5p可能作為反映肝衰竭嚴重程度的分子標志物。

【關(guān)鍵詞】microRNA;肝衰竭;分子標志物

中圖分類號： R736.1文獻標識碼： A文章編號： 2095-2457（2019）17-0214-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.17.101

Studying the Function of MiR-423-5p in the Mouse Model of Acute Hepatic Failure Model

SONG Guang-zhong WAN Shuang-shuang ZHOU Qian HUA Yu-feng YANG Jun

（School of Laboratory Medicine， Hangzhou Medical College， Hangzhou Zhejiang 310053， China）

【Abstract】Aim： to study the function of miR-423-5p in the Con A-induced acute hepatic failure model in mice. Method： Liver failure in mice was established by intravenously injection with Con A. RT-qPCR was performed to detect the levels of hepatic and serum miR-423-5p of the mice exposed to Con A for 6 h， 12 h and 24 h. The hepatic histological morphological damage was detected with HE staining. Serum ALT and AST levels were determined using automatic analyzer. Result： The levels of hepatic and serum miR-423-5p increased significantly with the development of liver failure. The levels of hepatic and serum miR-423-5p had significant positive correlation with hepatic necrosis rate， serum ALT and AST. Conclusion： miR-423-5p may serve as a molecular biomarker for the acute liver failure.

【Key words】microRNA; Liver Failure; Biomarker

0 引言

肝衰竭系肝細胞大量死亡和肝功能嚴重破壞所致的臨床癥候群。肝衰竭多起病兇險，治療難度高，預后較差。肝衰竭的發(fā)病機制復雜，是當今肝病學研究的熱點。尾靜脈注射刀豆蛋白A（Concanavalin A， Con A）能誘導小鼠產(chǎn)生急性肝損傷，是實驗室常用的研究免疫介導的肝衰竭動物模型[1-3]。microRNA （miRNA） 作為一類獨特的小分子非編碼RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白質(zhì)的合成， 參與眾多生理和病理過程。近年研究表明，miR-423-5p在心力衰竭、心肌梗死、胃癌等患者血漿或血清中表達水平升高，可能作為相關(guān)疾病的生物學標志物[4-6]。miR-423-5p在肝臟疾病進程中的功能及其作用機制研究較少， 本文就miR-423-5p在Con A誘導的小鼠急性肝衰竭模型中的功能作一探討。

1 研究方法

1.1 Con A誘導的小鼠急性肝衰竭模型的建立

BALB/c小鼠經(jīng)尾靜脈注射Con A制備急性肝衰竭模型（注射劑量為20mg/kg體重，Con A用注射用生理鹽水配制），正常對照組小鼠注射等量的生理鹽水。于 0h，6h，12h，24h 摘眼球取血，處死小鼠取肝組織。所取小鼠血液室溫靜置30min后2000g離心10min，將上層血清轉(zhuǎn)移至潔凈的EP管，再12000g離心10min去除細胞沉淀，得到血清樣品再分為兩份：一份稀釋 10 倍后用于小鼠血清 ALT和 AST檢測（全自動生化分析儀）;另一份100μl用于總RNA的抽提和制備。肝組織標本也分為兩份：一份肝組織標本用于常規(guī)固定、石蠟包埋、制備組織切片（用于常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色）;另一份肝組織標本用于總RNA的抽提和制備。

1.2 肝組織HE染色

取0h，6h，12h，24h肝組織，立即置于10%福爾馬林中固定，72h后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，行3-5μm切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學改變并計算肝細胞壞死率。

1.3 小鼠肝組織和血清RNA抽提及純化

小鼠肝組織總RNA（含小RNA）的提取按照Qiagen公司生產(chǎn)的miRNeasy Mini Kit說明書進行?；趍irVana PARIS試劑盒的使用說明并略作改動，從100 μl小鼠血清中提取總RNA。

1.4 RT-qPCR分析小鼠肝組織和血清miR-423-5p的表達水平

小鼠肝組織miR-423-5p表達水平的RT-qPCR分析參照TaqMan MicroRNA Assays試劑盒說明書，其中總RNA樣品濃度為100ng/μl，U6 snRNA作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。小鼠血清miR-423-5p表達水平的RT-qPCR分析也參照TaqMan MicroRNA Assays說明書，cel-miR-29作為外參，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。

2 研究結(jié)果

2.1 Con A制備的小鼠急性肝衰竭模型

在Con A暴露 6 h后，在此階段可見大量的炎性細胞浸潤，存在小的散在的炎癥壞死灶;在暴露12 h后，到處可見散亂的、片狀肝組織壞死灶;在暴露24 h后，可見大量的融合性壞死灶。參照Hasselblatt等[7]方法根據(jù)壞死區(qū)域面積占肝組織總面積的百分比來計算壞死率。在6-24 h組，ALT、AST水平顯著高于正常對照組（P<0.05），且呈現(xiàn)時間效應關(guān)系。

2.2 miR-423-5p表達水平和肝細胞壞死率等在小鼠急性肝衰竭模型中的相互關(guān)系

RT-qPCR證實小鼠肝組織和血清miR-423-5p表達水平隨著肝衰竭的嚴重程度顯著性增加，且呈現(xiàn)顯著的時間效應關(guān)系。Spearman相關(guān)性分析表明：小鼠肝組織和血清miR-423-5p的表達水平與肝細胞壞死率、血清ALT、AST水平呈顯著性正相關(guān)（見表1）。表明miR-423-5p可能作為反映肝衰竭嚴重程度的分子標志物。

3 討論

肝衰竭是由病毒感染、酒精、藥物、肝毒性物質(zhì)等多種因素引起的嚴重而廣泛的肝細胞死亡，導致肝臟本身合成、排泄、解毒、和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴重障礙，臨床上主要表現(xiàn)為凝血機制障礙、黃疸、肝性腦病等。肝組織在短期內(nèi)出現(xiàn)大塊或亞大塊壞死的分子機制尚不明了，臨床上依然缺乏可早期預警疾病發(fā)生、監(jiān)測疾病發(fā)展和嚴重程度的敏感、可靠、系統(tǒng)的有效指標，是肝衰竭難治性和不可預測性的根本原因。miRNA是一類長度約22個核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA， 可以穩(wěn)定地存在于血清、血漿等體液循環(huán)中，并可能作為診斷腫瘤和其它疾病的非侵襲性生物標志物。has-miR-423基因位于人染色體17q11區(qū)，最早從人早幼粒白血病細胞系（HL-60）鑒定出來，其成熟序列包括has-miR-423-5p和has-miR-423-3p。

miR-423-5p在肝衰竭進程中起著怎樣的功能和作用機制尚不明了。我們利用Con A制備的小鼠肝衰竭模型探討了miR-423-5p表達水平與肝衰竭進程的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)無論是肝組織還是血清中miR-423-5p表達水平都隨著肝衰竭進程顯著性增加，而且其表達水平與肝細胞壞死率、血清ALT、AST水平呈顯著性正相關(guān)，提示miR-423-5p可能作為反映肝衰竭嚴重程度的又一新型分子標志物。另外需要指出的是，本文只是在Con A誘導的小鼠肝衰竭模型中探討了miR-423-5p與肝衰竭進程的相互關(guān)系，初步研究結(jié)果提示miR-423-5p與肝衰竭進程關(guān)系密切，但差異表達的miR-423-5p在肝衰竭過程中的起著怎樣的功能和作用機制仍值得進一步深入研究和開展。這對于深入闡明肝衰竭進程的分子調(diào)節(jié)機制，尋求早期預測、預防和治療肝衰竭的新型分子靶標具有十分重要的意義。

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