加爾肯，庫來汗·巴依多拉，冉多良，艾海提·亞森，布力布力汗，劉建華*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，家畜傳染病實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊 830063；3.新疆畜牧科學(xué)院，烏魯木齊 830011)

馬鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis，ER)是一種引起妊娠馬流產(chǎn)和呼吸道疾病為特征的高度接觸性傳染病[1]。馬鼻肺炎病原體為兩種皰疹病毒，馬皰疹病毒1型（EHV-1）和4型（EHV-4），表現(xiàn)為單克隆抗體對(duì)抗原的反應(yīng)不同，核苷酸序列的同源為55%-84%，氨基酸序列的同源性55%-96%，基因長度分別為150.2kb和145.6kb。馬鼻肺炎首先由Dimock和Adwards于1933年在美國的肯塔基州發(fā)現(xiàn)[2]。1954年12月首次在我國察北牧場發(fā)現(xiàn)本病[3]。楊永龍[4]等從流產(chǎn)胎兒中分離出EHV-1，證實(shí)了該病在新疆地區(qū)的存在。EHV-1在新疆以高感染率形式出現(xiàn)，如果不深入調(diào)查研究，不采取嚴(yán)格的防治措施，將造成更大的危害[5]。

馬皰疹病毒（Equine herpes virus，EHV）屬于皰疹病毒科、皰疹病毒α亞科、水痘病毒屬。EHV-1是由雙股線型DNA分子及囊膜構(gòu)成的120～200nm病毒粒子[6]，成熟的馬皰疹病毒帶有囊膜呈球形或不規(guī)的球形，囊膜內(nèi)是直徑15～200 nm的20面體核衣殼，由162個(gè)殼粒組成。在超薄切片的標(biāo)本上可見病毒核心呈十字形現(xiàn)象，這一現(xiàn)象只在幾種少數(shù)病毒中可見，其他皰疹病毒并無此特征，因此具有一定的鑒別意義。

EHV-1主要引起孕馬病毒性流產(chǎn)，輕度呼吸道癥狀、馬駒死亡、腦脊髓炎等神經(jīng)性癥狀。EHV-1所引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病又稱為馬皰疹病毒性腦脊髓?。‥quine herpes myeloencephalopathy，EHM）近年來世界上由EHV-1引起的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀有上升趨勢，其主要表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)，后肢和腰部麻痹，甚至癱瘓死亡。

表1 引物和序列

EHV-1病毒ORF30基因2254點(diǎn)突變與其神經(jīng)性密切相關(guān)。流產(chǎn)型株：腺嘌呤（A）—AAU和AAC序列的核苷酸，產(chǎn)生天冬酰胺（N752）。神經(jīng)型毒株：鳥嘌呤（G）—GAU和GAC序列的一種核苷酸，能產(chǎn)生天冬氨酸（D752）。天冬氨酸（D752）取代天冬酰胺（N752）位置，一個(gè)點(diǎn)的基因突變，產(chǎn)生馬皰疹病毒的流產(chǎn)株變?yōu)樯窠?jīng)性毒株[7]。

為了鑒定新疆株EHV-1-XJ2015株的表型特征，本研究對(duì)EHV-1-XJ2015毒株ORF30基因進(jìn)行克隆，并對(duì)原核表達(dá)載體分析，PCR技術(shù)擴(kuò)增EHV-1-XJ2015分離株ORF30基因相應(yīng)區(qū)域[8]，連接至克隆載體pMD19-T-ORF30，對(duì)重組質(zhì)粒pET-28a(+)-ORF30進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定。為馬鼻肺炎預(yù)防和疫苗的研究提供微小理論依據(jù)，從而以減少養(yǎng)馬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材 料

1.1 毒株

EHV-1-XJ2015毒株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

pMD19-T、pET-28a(+)、兩種雙切酶均購自Takara寶生物（大連）工程有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自O(shè)mega公司均購自DNA Marker；DL1000/10000DNA Marker購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司

2 方 法

2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的EHV-1病毒ORF30基因序列，用DNAStar軟件設(shè)計(jì)特異性引物并將引物序列交新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1，并分別在引物的上下游中添加BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)。

2.2 ORF30基因的PCR擴(kuò)增

將使用病毒DNA提取試劑盒提取病毒基因組，然后以EHV-1病毒ORF30基因組為模板，以選定P1和P2為特異性引物，對(duì)ORF30基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下 （50 μL）：2Taq Master Mix25.0 μL，上游引物（10 μmol/L）1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，模板 DNA2.0 μL，無菌ddH2O 21.0 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)如下：98℃預(yù)變性5 min，98℃變性5 min，53.98℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。取擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測確認(rèn)。

2.3 目的基因的克隆

將回收獲得的目的基因DNA片段與pMD19-T載體按照說明書要求進(jìn)行連接，使用熱轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Amp＋抗性的LB固體平板用于篩選陽性重組質(zhì)粒。挑取陽性重組菌進(jìn)行活化擴(kuò)增，次日使用天根質(zhì)粒DNA提取試劑盒按照說明書操作提取重組質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定，分別收取PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-ORF30，將鑒定成功的重組菌密封，送至新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定處理。

2.4 目的基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將測序正確的pMD19-T-ORF30質(zhì)粒與pET-32a（+）表達(dá)載體共同使用BamH I、Hind III進(jìn)行雙酶切；取雙酶切產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，按照說明書操作步驟使用天根凝膠回收試劑盒將檢測正確的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收處理，膠回收后于16℃金屬浴連接儀中連接3 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有Kana+的LB培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過夜。選取單克隆菌落并對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定；鑒定為陽性的重組質(zhì)粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測序，測序重組質(zhì)粒命名為pET28a-ORF30。

3 結(jié)果與分析

3.1 ORF30基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以EHV-1病毒ORF30基因DNA為模板，P1/P2為選為上下引物，用PCR擴(kuò)增ORF30基因，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，其清晰的條帶約為1074bp，與預(yù)期的相符（圖1）。

圖1 ORF30基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.2 原核表達(dá)載體pET-28a(+)-ORF30的鑒定結(jié)果

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-ORF30經(jīng)BamhⅠ和HindⅢ雙酶切，后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果與預(yù)期相符（圖2），表明目的片段成功插入載體pET28a(+)中。采用特異性引物對(duì)重組質(zhì)粒pET28a(+)-ORF30進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，得到一條大小約1074bp的清晰條帶（圖3），與目的基因大小相符。對(duì)陽性重組質(zhì)粒測序，結(jié)果與GenBank公布序列一致，表明重組質(zhì)粒pET28a(+)-ORF30構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-ORF30雙酶切鑒定結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-ORF30 PCR擴(kuò)增結(jié)果

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)以皰疹病毒EHV-1 ORF30基因選為目的基因，對(duì)ORF30基因構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pET-28a(+)，在適應(yīng)的條件下對(duì)表達(dá)重組蛋白進(jìn)行優(yōu)化[9]，獲得了較高水平的目的蛋白表達(dá)。蛋白作為診斷抗原可用于ORF30基因表達(dá)的診斷，為預(yù)防馬鼻肺炎暴發(fā)提供了有利的依據(jù)。EIV-1毒株有高度保守的150kb雙鏈DNA基因組，彼此間僅有0.1%的核苷酸差異。本研究發(fā)現(xiàn)EHV-1-XJ2015毒株ORF30基因，通過對(duì)ORF30基因部分克隆的氨基酸序列比較分析，發(fā)現(xiàn)EHV-1分離毒株具有氨基酸序列高度保守性[3]，甚至同源性達(dá)到為97.3%～100%，表明，EHV-1基因組中具有良好的完整性和保守性。在少數(shù)位點(diǎn)出現(xiàn)的差異可能與病毒的生存的環(huán)境及其宿主的適應(yīng)性有關(guān)，但對(duì)ORF30基因2254點(diǎn)部位的鑒定和分析，可確定DNA聚合酶對(duì)此突變密切相關(guān)。

大腸桿菌是基因表達(dá)的重要工具[10]，在生物技術(shù)進(jìn)入基因工程時(shí)代，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究不斷的更深對(duì)基因方面的研究提出了更高的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)以pET-28a(+)載體為原核表達(dá)載體，構(gòu)建了ORF30基因的原核表達(dá)載體，這為進(jìn)一步制備EHV-1病毒DNA聚合酶多克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。

大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)是最常用的表達(dá)系統(tǒng)，是使用最廣泛且最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。此種方法具有遺傳穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)量較高、表達(dá)后的產(chǎn)物容易提純、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，這也是選擇大腸桿菌作為表達(dá)工具的主要原因。

本研究從新疆分離株中擴(kuò)增了EHV-1-XJ2015/ORF30基因，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，將原核表達(dá)載體pET-28a(+)與ORF30基因重組，進(jìn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將表達(dá)目的蛋白質(zhì)（DNA聚合酶），為進(jìn)一步探討馬皰疹病毒1型ORF30基因遺傳變異對(duì)DNA聚合酶功能的影響奠定了基礎(chǔ)。

5 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(+)-ORF30，采用特異性引物對(duì)重組質(zhì)粒pET28a(+)-ORF30進(jìn)行PCR鑒定，片段大小為1074bp，將測序結(jié)果與GenBank的EHV-1 ORF30基因進(jìn)行對(duì)比，其核苷酸序列同源性為99%。