平曉芳 崔錫梅 陳偉 邢衛(wèi)斌

天津市第五中心醫(yī)院皮膚科 300450

腫瘤血管生成對(duì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮依賴性血管并不是黑素瘤血液供應(yīng)的唯一來(lái)源[1]，1999年 Maniotis 首次提出侵襲性葡萄膜黑素瘤細(xì)胞在特定情況下模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞形成一種功能上類似于正常血管的管道，可以與常規(guī)的內(nèi)皮血管相通連，構(gòu)成網(wǎng)狀的血液輸送循環(huán)，從而為腫瘤提供必要的營(yíng)養(yǎng)支持，這一過程被定義為血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）[2]。目前已證實(shí)，包括黑素瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均存在VM[3-4]，并且其陽(yáng)性率與腫瘤級(jí)別及患者的預(yù)后密切相關(guān)[5]。VM 的形成機(jī)制目前尚不完全清楚，可能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）[6]高表達(dá)有關(guān)。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗腫瘤[7]、抗炎、抗氧化[8]、抗菌、降尿酸等多種藥理作用。研究表明，木犀草素體外可劑量依賴性抑制乳腺癌和前列腺癌的脂肪酸合成酶活性，進(jìn)而抗腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)并促其凋亡[9]。木犀草素還可抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)能力，可能與抑制MMP-9 分泌及下調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2 的表達(dá)有關(guān)。本研究旨在探究木犀草素對(duì)黑素瘤的進(jìn)展及VM形成的影響，為黑素瘤的治療提供新思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

B16小鼠黑素瘤細(xì)胞系（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），木犀草素[純度98%，成都普思生物科技有限公司，CR 級(jí)，溶于二甲基亞砜（DMSO）]，1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司），噻唑藍(lán)（MTT）（上海克拉瑪爾公司）；Matrigel基質(zhì)（美國(guó)BD公司），兔抗鼠血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-Cad）、MMP-2、MMP-9 單抗（美國(guó)Abcam 公司），兔抗鼠CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體 1（VEGFR1）、VEGFR2 單抗（美國(guó) Affinity 公司）。實(shí)驗(yàn)小鼠（C57）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2016-0006]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：No.11400700314508。

二、方法

1.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取正常培養(yǎng)的B16 細(xì)胞，以5 000 個(gè)/100 μl 鋪于 96 孔板中，24 h 后加木犀草素，溶劑為0.1%二甲基亞砜，藥物濃度設(shè)為0（對(duì)照組）、0.5、1、2、4、6、8、10、20、40 μmol/L，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，加藥24 h后，每孔加入5 × MTT 25 μl，37 ℃孵育4 h，酶標(biāo)儀于562 nm處測(cè)吸光度（A值）。細(xì)胞增殖活性抑制率 =[（A對(duì)照組-A給藥組）/A對(duì)照組]×100%，計(jì)算IC50值。結(jié)果顯示，木犀草素對(duì)B16細(xì)胞的 IC50 值為 23.84 μmol/L（R= 0.92），后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)中木犀草素低、中、高劑量分別采用2.5、5、10 μmol/L。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：B16 細(xì)胞用含10% FBS、1%青鏈霉素雙抗的1640 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)2 代后分為4 組，對(duì)照組正常培養(yǎng)，木犀草素低、中、高劑量組另加入2.5、5、10 μmol/L 木犀草素，培養(yǎng)48 h 收集細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

3.劃痕實(shí)驗(yàn)：將4 組B16 細(xì)胞接種于24 孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，棄原培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，在細(xì)胞表面劃痕，PBS清洗脫落細(xì)胞，換為含1%FBS的1640培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察，依次記錄0、24、48 h 劃痕寬度并隨機(jī)選取視野拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。以相對(duì)劃痕寬度衡量遷移能力，相對(duì)劃痕寬度=劃痕寬度/原始寬度，相對(duì)劃痕寬度越小遷移能力越強(qiáng)。

4.侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel 膠和1640培養(yǎng)基按照體積比 1∶2 混勻，取 100 μl 鋪至 Transwell 小室表面，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中凝固1 h；取無(wú)血清培養(yǎng)基懸起的各組B16細(xì)胞200 μl（約5×105個(gè)/ml）加至上室中，下室加入含20% FBS 的1640 培養(yǎng)基300 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，穿過的細(xì)胞用預(yù)冷的多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，各組隨機(jī)拍照，并記錄穿過細(xì)胞數(shù)目，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.管道形成實(shí)驗(yàn)：將Matrigel 膠和1640培養(yǎng)基按照體積比1∶2混勻，鋪至6孔板中，凝固1 h；用含10% FBS 的 1640 培養(yǎng)基懸起各組細(xì)胞，取 2 ml 加至6孔板中（約4 × 105個(gè)/ml），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，顯微鏡（×10）下觀察管道形成情況，記錄各組管道數(shù)量，并隨機(jī)選取視野拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.細(xì)胞免疫熒光：將對(duì)照組和木犀草素高劑量組 B16 細(xì)胞懸液 500 μl（約 1.5 × 105個(gè)/ml）接種于24 孔板的爬片上，細(xì)胞貼壁后，PBS 洗 3 次，固定、封閉后，加入 VE-Cad（1∶200）、VEGFR1（1∶300）、VEGFR2（1∶300）、MMP-2（1∶200）、MMP-9（1∶200）抗體，室溫30 min后置4 ℃過夜，棄一抗，PBS清洗，加入相應(yīng)PBS 稀釋的熒光二抗（1∶200），避光孵育1 h，用帶甘油的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染核封片，熒光顯微鏡（×60）下觀察并拍照，熒光強(qiáng)度用ImageJ定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.黑素瘤形成實(shí)驗(yàn)：6 ～ 8 周齡雌性、體重23 ～25 g的SPF級(jí)C57小鼠12只，分為對(duì)照組和木犀草素低、中、高劑量組，每組3只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將B16黑素瘤細(xì)胞懸液注射于小鼠左側(cè)背部皮下，約2×106個(gè)細(xì)胞/只，1 周后于皮下觸及腫瘤，開始給藥。木犀草素高、中、低劑量組每天分別給予40、20、10 mg/kg（超純水配置）木犀草素0.1 ml 灌胃，對(duì)照組給予0.1 ml 超純水，隔天觀察小鼠狀態(tài)，記錄小鼠體重及瘤體積，腫瘤體積=（長(zhǎng)徑× 短徑）2/2。給藥至荷瘤第28 天時(shí)處死全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，解剖取小鼠肺及腫瘤組織，切片后HE染色，觀察肺轉(zhuǎn)移情況，計(jì)算各組肺相對(duì)轉(zhuǎn)移面積（相對(duì)于腫瘤組織），相對(duì)轉(zhuǎn)移面積為同一顯微鏡4 倍視野下轉(zhuǎn)移灶的測(cè)量值。

8.腫瘤組織免疫組化[10]及CD31-過碘酸希夫（PAS）雙染[11]：參照相應(yīng)文獻(xiàn)進(jìn)行免疫組化和雙染實(shí)驗(yàn)。最后，顯微鏡下觀察拍照，10倍鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野分別計(jì)數(shù)VM，取均值。VM 判定標(biāo)準(zhǔn)：CD31陰性，PAS染色陽(yáng)性，腫瘤細(xì)胞排列成管壁結(jié)構(gòu)，管腔中央有紅細(xì)胞存在[11-12]。對(duì)照組及木犀草素高劑量組腫瘤組織另做VE-Cad、VEGFR1、VEGFR2、MMP-2、MMP-9免疫組化染色，計(jì)算染色指數(shù)。染色指數(shù)=染色面積×染色強(qiáng)度[10]。

9.腫瘤組織內(nèi)木犀草素濃度檢測(cè)：腫瘤組織按1∶3質(zhì)量比加入去離子水，勻漿，1 700×g4 ℃離心10 min，取上清液 100 μl，加入 10 μl IS 工作液和500 μl 甲醇，渦旋3 min，沉淀蛋白，4 ℃、4 000 ×g離心沉淀，取上清液20 μl 進(jìn)樣分析。用質(zhì)譜法分析木犀草素濃度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、體外實(shí)驗(yàn)

1.木犀草素對(duì)B16細(xì)胞遷移能力的影響：見圖1。對(duì)照組和低、中、高劑量木犀草素組細(xì)胞在48 h時(shí)相對(duì)痕寬度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 34.51，P＜0.001），木犀草素各組細(xì)胞遷移能力均低于對(duì)照組（t值分別為5.83、9.25、12.72，均P＜ 0.05），中、高劑量組均低于低劑量組（t值分別為2.61、5.23，均P＜0.05），高劑量組低于中劑量組（t=2.61，P＜ 0.05）。

2.木犀草素對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響：見表1、圖2。對(duì)照組和低、中、高劑量木犀草素組穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），木犀草素各組侵襲能力均低于對(duì)照組（t值分別為14.21、24.66、30.82，均P＜ 0.01），其中木犀草素中、高劑量組均低于低劑量組（t值分別為9.13、13.21，均P＜ 0.001），高劑量組低于中劑量組（t= 4.10，P＜ 0.05）。

3.木犀草素對(duì)B16細(xì)胞管道生成能力的影響：見表1、圖2。對(duì)照組和低、中、高劑量組細(xì)胞的管道形成數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），低、中、高劑量組均低于對(duì)照組（t值分別為4.91、7.51、11.78，均P＜ 0.01），中、高劑量組均低于低劑量組（t值分別為2.27、5.52，均P＜ 0.05），高劑量組低于中劑量組（t=3.24，P＜ 0.01）。

表1 體外實(shí)驗(yàn)中不同濃度木犀草素對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力、管道生成能力的影響（±s）

表1 體外實(shí)驗(yàn)中不同濃度木犀草素對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力、管道生成能力的影響（±s）

注：n=3

組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組F值P值侵襲能力（細(xì)胞數(shù)）281.00±8.79 169.00±15.35 92.00±14.79 57.00±13.72 275.30＜0.001管道生成能力（管道數(shù)）20.00±2.768 11.00±1.279 7.00±1.865 2.00±1.324 48.61＜0.001

4.木犀草素對(duì)B16細(xì)胞VM相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平的影響：細(xì)胞水平的免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，木犀草素高劑量組VE-Cad、VEGFR1、VEGFR2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組（圖3），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為6.97、11.64、5.74、10.87、5.14，均P＜ 0.05）。

二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

圖1 木犀草素對(duì)B16細(xì)胞遷移能力的影響 低、中、高劑量木犀草素組在24、48 h時(shí)的遷移能力均低于對(duì)照組。1A：各組細(xì)胞相對(duì)劃痕寬度隨時(shí)間變化情況；1B：顯微鏡下觀察各組劃痕愈合情況

1.木犀草素對(duì)黑素皮下移植瘤模型小鼠體重及腫瘤生長(zhǎng)的影響：第28 天時(shí)木犀草素給藥組和對(duì)照組小鼠體重較實(shí)驗(yàn)開始時(shí)均有下降，4組小鼠體重（g）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.93，P＜ 0.001），對(duì)照組低于各木犀草素給藥組（t值分別為6.30、18.42、13.19，均P＜ 0.01），中、高劑量組均高于低劑量組（t值分別為7.26、11.51，均P＜ 0.01），高劑量組高于中劑量組（t= 4.23，P＜ 0.05）。見圖4。腫瘤生長(zhǎng)的第28天，對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組腫瘤終體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.76，P＜0.001），低、中、高劑量木犀草素組腫瘤體積均小于對(duì)照組（t值分別為 3.86、7.11、13.06，均P＜0.01），中、高劑量組均低于低劑量組（t值分別為3.94、10.54，均P＜ 0.01），高劑量組低于中劑量組（t=6.59，P＜ 0.05）。見圖5。

圖2 木犀草素對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力及管道形成能力的影響

圖3 木犀草素對(duì)B16細(xì)胞血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-Cad）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）1、VEGFR2、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2、MMP9蛋白表達(dá)水平的影響 高劑量組均低于對(duì)照組（P ＜0.05）

圖4 木犀草素對(duì)黑素瘤皮下移植瘤小鼠體重的影響 低、中、高劑量組小鼠體重均高于對(duì)照組

圖5 木犀草素對(duì)黑素瘤皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 5A：第28天時(shí)各組移植瘤體積對(duì)比；5B：各組移植瘤體積隨時(shí)間變化情況

表2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不同劑量木犀草素對(duì)小鼠黑素瘤皮下移植瘤血管生成擬態(tài)（VM）形成數(shù)量、肺轉(zhuǎn)移灶面積的影響及腫瘤組織中木犀草素的含量（±s）

表2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不同劑量木犀草素對(duì)小鼠黑素瘤皮下移植瘤血管生成擬態(tài)（VM）形成數(shù)量、肺轉(zhuǎn)移灶面積的影響及腫瘤組織中木犀草素的含量（±s）

注：n=3

組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組F值P值VM形成數(shù)量（個(gè)）5.00±0.81 4.00±0.80 2.00±0.57 1.00±0.50 48.61＜0.001肺轉(zhuǎn)移灶面積（cm2）10.67±0.78 8.33±0.58 5.32±0.54 3.60±0.82 54379＜0.001木犀草素含量（μg/g）-0.060±0.010 0.075±0.005 0.113±0.032 5.88 0.04

圖6 木犀草素對(duì)黑素瘤皮下移植瘤小鼠血管生成擬態(tài)形成能力的影響 箭頭處為血管生成擬態(tài)（CD31-PAS雙染×10）

圖7 木犀草素對(duì)黑素瘤皮下移植瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移的影響 低、中、高劑量組肺轉(zhuǎn)移面積均低于對(duì)照組。圖中比例尺單位為200 μm

2.木犀草素對(duì)皮下移植瘤小鼠VM 形成能力的影響：CD31-PAS雙染結(jié)果顯示，對(duì)照組和低、中、高劑量組VM 形成數(shù)量（表2）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），對(duì)照組VM 形成數(shù)量高于各木犀草素組（t值分別為2.61、5.00、7.83，均P＜ 0.01），中、高劑量組均低于低劑量組（t值分別為2.89、5.77，均P＜ 0.05），高劑量組低于中劑量組（t= 2.887，P＜0.05）。見圖6。

3.木犀草素對(duì)黑素瘤皮下移植瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移的影響：木犀草素組和對(duì)照組小鼠均存在肺轉(zhuǎn)移，4 組肺轉(zhuǎn)移灶面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 54.79，P＜ 0.001），各木犀草素組均低于對(duì)照組（t值分別為4.00、8.50、9.80，均P＜ 0.05）。見表2、圖7。

4.木犀草素對(duì)小鼠黑素瘤皮下移植瘤組織中VM相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平的影響：免疫組化染色結(jié)果顯示，VE-Cad、VEGFR1、VEGFR2、MMP-2、MMP-9主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，木犀草素高劑量組VE-Cad、VEGFR1、VEGFR2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為 14.55、12.34、13.98、13.98、14.79，均P＜ 0.05）。見圖8。

圖8 木犀草素對(duì)小鼠黑素瘤皮下移植瘤組織中血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-Cad）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）1、VEGFR2、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2、MMP9表達(dá)水平的影響（免疫組化×20） 8A：對(duì)照組和高劑量各蛋白表達(dá)水平柱狀圖，a：P ＜0.05；8B：免疫組化觀察兩組各蛋白表達(dá)水平

5.腫瘤組織內(nèi)木犀草素含量測(cè)定：質(zhì)譜結(jié)果顯示，木犀草素低、中、高劑量組腫瘤組織內(nèi)木犀草素含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04）。

討 論

黑素瘤是一種高轉(zhuǎn)移、高侵襲性的惡性腫瘤。VM 最初在侵襲性黑素瘤中被發(fā)現(xiàn)，隨后研究不斷證實(shí)多種腫瘤中均存在這種與經(jīng)典腫瘤血管生成方式不同的模式，并與預(yù)后密切相關(guān)[13-14]，其機(jī)制尚未明確，主要認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞的可塑性相關(guān)[15]。腫瘤細(xì)胞可表達(dá)多種與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的基因，如VEGF、MMP等。MMP可通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)腫瘤VM 形成；VEGF 除了促進(jìn)內(nèi)皮依賴性血管生成外，也可以促進(jìn)VM 形成；VE-Cad 是很多VM 調(diào)控因子的關(guān)鍵蛋白[16]。木犀草素是一種具有代表性的天然黃酮，除了抑制腫瘤增殖外[16]，還可通過抑制MMP活性來(lái)抑制腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。木犀草素可抑制腫瘤內(nèi)皮依賴性血管生成能力[17]。

本研究在體外和體內(nèi)分別探究了木犀草素對(duì)黑素瘤的惡性演進(jìn)能力的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證了既往報(bào)道的木犀草素對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖能力的抑制作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)，木犀草素在體外可抑制黑素瘤B16細(xì)胞的遷移與侵襲，在體內(nèi)可控制小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移，且體內(nèi)、體外均能抑制VM 形成?？梢种芕M 標(biāo)志物MMP 及血管生成相關(guān)蛋白VEGF、VE-cadherin 的表達(dá)，提示木犀草素可能通過抑制這些蛋白的表達(dá)抑制黑素瘤細(xì)胞VM形成，進(jìn)而抑制腫瘤惡性演進(jìn)。

本研究顯示，木犀草素可以通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)重塑和血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制黑素瘤VM形成，進(jìn)而抑制小鼠黑素移植瘤的生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。此外，我們發(fā)現(xiàn)，給予木犀草素后，荷瘤小鼠的體重較實(shí)驗(yàn)開始時(shí)均有所下降，但比對(duì)照組的下降的幅度小，提示木犀草素對(duì)機(jī)體的毒副作用較小，未來(lái)有望被開發(fā)為特異性靶向VM 的治療黑素瘤的藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突