陳金敏

摘要：拉曼光譜成像技術(shù)是分析化學(xué)、細(xì)胞研究等領(lǐng)域的重要工具。利用拉曼光譜成像觀測(cè)某些動(dòng)態(tài)變化的反應(yīng)過(guò)程時(shí)，拉曼光譜數(shù)據(jù)集的信噪比低和成像過(guò)程的數(shù)據(jù)處理速度慢是兩個(gè)主要制約因素[1]。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)快速過(guò)程的實(shí)時(shí)成像，需要對(duì)信噪比較低的拉曼成像數(shù)據(jù)進(jìn)行信息提取，良好的微弱信息提取算法將有效提高拉曼成像的時(shí)間分辨率，并減弱噪聲影響。本文通過(guò)對(duì)不同掃描時(shí)間下的三種藥品和不同曝光時(shí)間的細(xì)胞的拉曼數(shù)據(jù)，利用MATLAB對(duì)其成像，并用不同方法對(duì)其信息提取，同時(shí)利用局部數(shù)據(jù)進(jìn)行SNR估計(jì)。在拉曼圖像的清晰度與SNR估計(jì)值之間建立一個(gè)聯(lián)系，通過(guò)對(duì)局部數(shù)據(jù)的信噪比估計(jì)，判斷圖像清晰度，直接選取符合實(shí)驗(yàn)要求的掃描時(shí)間，進(jìn)而達(dá)到快速成像和減噪的目的。

關(guān)鍵詞：拉曼成像;信息提取;信噪比

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.37 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-9416（2019）04-0100-04

0 引言

拉曼效應(yīng)，也稱(chēng)做拉曼散射，是在1928年由印度物理學(xué)家Sir Chandrasekhara Venkata Raman發(fā)現(xiàn)的。拉曼光譜就是一種基于拉曼散射效應(yīng)的散射光譜[2]。拉曼光譜可以直接檢測(cè)和識(shí)別樣品中的分子物種，而無(wú)需任何標(biāo)記或修飾[3]，為研究晶體或分子結(jié)構(gòu)提供了重要手段。另外，根據(jù)獲取的多條光譜通過(guò)一定處理后可以進(jìn)一步生成拉曼圖像。拉曼成像技術(shù)將共聚焦顯微鏡技術(shù)與拉曼光譜技術(shù)完美結(jié)合[4]，成像分辨率高。

當(dāng)利用拉曼光譜成像快速變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程時(shí)，采用較短的掃描或曝光時(shí)間，此時(shí)采集得到的拉曼光譜數(shù)據(jù)信噪比低，拉曼信號(hào)會(huì)受到噪聲的影響，有用信號(hào)可能會(huì)淹沒(méi)在噪聲中，嚴(yán)重影響進(jìn)一步分析。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者也提出了各種方法用于拉曼光譜噪聲去除。例如，基于匹配追蹤的拉曼光譜信號(hào)重構(gòu)算法[5]，基于形狀相似性比較消除拉曼光譜背景噪聲[6]，基于LMS自適應(yīng)的拉曼光譜去噪方法研究[7]等，他們對(duì)拉曼光譜的去噪效果都十分有效，但同其他現(xiàn)有研究技術(shù)一樣，這些方法都是直接對(duì)受干擾嚴(yán)重的拉曼光譜進(jìn)行減噪處理。而拉曼成像主要通過(guò)拉曼逐點(diǎn)掃描成像采集光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)分析整合每個(gè)點(diǎn)上的拉曼光譜，進(jìn)而生成拉曼圖像。掃描完所有數(shù)據(jù)點(diǎn)需要一定時(shí)間，而得到的掃描結(jié)果又受噪聲影響，光譜或圖像不夠清晰。此時(shí)，如果采用傳統(tǒng)方式先對(duì)拉曼光譜逐一去噪，再進(jìn)行拉曼成像，過(guò)程太過(guò)繁瑣，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，效率大大降低。

因此，本文提出一種快速成像的方法。我們將根據(jù)提供的三種藥品和細(xì)胞在不同掃描時(shí)間下的拉曼數(shù)據(jù)，對(duì)其信息進(jìn)行提取并成像，同時(shí)利用局部數(shù)據(jù)進(jìn)行SNR估計(jì)。在后續(xù)的研究中，研究人員可以通過(guò)該算法先對(duì)局部數(shù)據(jù)進(jìn)行信噪比估計(jì)，進(jìn)而判斷不同曝光時(shí)間下的圖像清晰度，直接選取符合實(shí)驗(yàn)要求的曝光時(shí)間，進(jìn)而達(dá)到快速成像和減噪的目的，從而提高研究效率。

1 理論

1.1 拉曼成像

拉曼成像技術(shù)是一種基于拉曼光譜的化學(xué)表征成像方法。本文選定譜峰面積作為反映拉曼光譜數(shù)據(jù)信息的衡量指標(biāo)，即用譜峰面積來(lái)代表一條拉曼光譜。利用累加峰強(qiáng)法[8]計(jì)算峰面積。累加峰強(qiáng)法是由Wasson峰面積法[9]進(jìn)一步發(fā)展而來(lái)的。Wasson峰面積法是一種快速計(jì)算峰面積的方法。它是一種在譜峰區(qū)域內(nèi)，對(duì)譜峰數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)累加的過(guò)程，是象征意義上的譜峰面積。其計(jì)算公式為：

其中，yi為譜峰區(qū)域內(nèi)第i個(gè)采集點(diǎn)上的拉曼數(shù)據(jù)，n為譜峰區(qū)域上的數(shù)據(jù)總數(shù)，bn與b-n分別為譜峰區(qū)域左右兩邊的基底數(shù)據(jù)。

累加峰強(qiáng)法是目前國(guó)內(nèi)外計(jì)算譜峰面積最普遍的方法之一。累加峰強(qiáng)法表明，譜峰面積可以直接通過(guò)譜峰區(qū)域采樣點(diǎn)數(shù)據(jù)的累加來(lái)表示。它的計(jì)算公式：

即拉曼光譜譜峰面積就是譜峰上各點(diǎn)的總和。這種方法受到噪聲的影響也比較明顯，因此一般可以選擇先對(duì)光譜進(jìn)行一定的去噪處理后再用該方法計(jì)算譜峰面積。

直接拉曼成像的具體步驟為：選取成像區(qū)域;計(jì)算峰面積;直接拉曼成像。

1.2 拉曼圖像信息提取

拉曼光譜的檢測(cè)靈敏度低[10]，儀器采集的原始拉曼光譜中也包含了會(huì)對(duì)光譜信息產(chǎn)生干擾的噪聲信號(hào)。為了克服噪聲對(duì)拉曼光譜成像的干擾，常用的信息提取方法有：數(shù)據(jù)平滑處理，傅里葉變換，小波變換，濾波法等。

（1）數(shù)據(jù)平滑處理。平滑處理的常用方法有移動(dòng)平均法和移動(dòng)中值法等。他們均是通過(guò)創(chuàng)建一個(gè)數(shù)據(jù)窗口，對(duì)窗口內(nèi)的數(shù)據(jù)分別求平均值和中值，并移動(dòng)窗口完成所有數(shù)據(jù)的處理，得到結(jié)果。（2）傅里葉變換。傅里葉變換是一種被廣泛使用的信號(hào)處理和圖像處理技術(shù)。它對(duì)光譜的處理實(shí)質(zhì)上就是把原始光譜分解成若干個(gè)頻率不相同的正弦波，再將這些正弦波進(jìn)行重新疊加的一個(gè)過(guò)程。（3）小波變換。小波變換是傅里葉變換的進(jìn)一步延伸，可以對(duì)信號(hào)或圖像進(jìn)行除噪，數(shù)據(jù)壓縮等作用。小波變換的具體步驟為：選定小波基和分解層數(shù)，然后對(duì)分解的各層系數(shù)進(jìn)行閾值處理，最后再對(duì)新的小波分解結(jié)構(gòu)進(jìn)行重構(gòu)。（4）濾波法。利用濾波法對(duì)光譜或者圖像去噪時(shí)，實(shí)質(zhì)上就是進(jìn)行卷積操作。根據(jù)不同的原理或者算法，濾波法又可以細(xì)分為數(shù)字濾波，同態(tài)濾波，中值濾波，均值濾波等不同的具體方法。數(shù)字濾波器有低通、高通、帶通、帶阻和全通等不同類(lèi)型。同態(tài)濾波是一種廣泛用于信號(hào)和圖像處理的技術(shù)。同態(tài)濾波器首先利用非線性映射，將原始信號(hào)映射到可以使用線性濾波器的其他域，在這個(gè)域內(nèi)做完相關(guān)濾波運(yùn)算后，再映射回原始域。同態(tài)濾波主要是通過(guò)增加圖像的對(duì)比度以及標(biāo)準(zhǔn)化亮度，來(lái)達(dá)到圖像去噪和圖像增強(qiáng)的效果。中值濾波與均值濾波都是能有效去除原始信號(hào)中的噪聲干擾的信號(hào)處理技術(shù)。他們的具體實(shí)現(xiàn)步驟如：首先選定一個(gè)數(shù)據(jù)窗口，然后分別用窗口中所有數(shù)據(jù)的中值或平均值取代要處理的數(shù)據(jù)，使數(shù)字圖像或序列上的數(shù)據(jù)值都盡可能的接近真實(shí)值，從而消除噪聲。

本文提出兩種不同的對(duì)拉曼光譜進(jìn)行信息提取的思路。第一，對(duì)拉曼光譜進(jìn)行信息提取。拉曼成像技術(shù)是在拉曼光譜的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的，因此我們可以先對(duì)拉曼光譜進(jìn)行信息提取，減除噪聲影響后，再進(jìn)行成像。第二，對(duì)拉曼圖像進(jìn)行信息提取。該方法在拉曼光譜成像后，在圖像基礎(chǔ)上進(jìn)行信息提取，即圖像減噪。

1.3 圖像信噪比估計(jì)

信噪比，簡(jiǎn)稱(chēng)SNR或S/N（SIGNAL-NOISE RATIO），用于有用信號(hào)的強(qiáng)度與背景噪聲的強(qiáng)度之間的比較。圖像信噪比就是用于衡量信息提取效果或者去噪效果的一個(gè)重要指標(biāo)。根據(jù)信噪比的定義，我們可以得到信噪比的計(jì)算公式為：

其中，ps為信號(hào)的有用功率，pn為噪聲的有用功率。但是光譜的頻率通常難以計(jì)算。

峰值信噪比（PSNR，RPSN）定義為[11]，是譜峰峰高與含噪標(biāo)準(zhǔn)差之間的比值。峰值信噪比是目前最廣泛使用的評(píng)價(jià)圖像質(zhì)量的客觀標(biāo)準(zhǔn)，它經(jīng)常被用于在圖像壓縮后信號(hào)重建的質(zhì)量檢測(cè)。一般的，峰值信噪比常通過(guò)原圖像與處理后圖像之間的均方誤差（MSE）進(jìn)行定義，其計(jì)算公式為：

其中，I和K分別是兩個(gè)m*n的單色圖像，其中一個(gè)為原始圖像，另一個(gè)則是去噪后的圖像，則他們的均方誤差就可以用式5表示。

本文利用峰值信噪比對(duì)拉曼圖像進(jìn)行信噪比估計(jì)，具體步驟如：（1）裁剪部分圖像數(shù)據(jù);（2）對(duì)局部數(shù)據(jù)進(jìn)行信噪比估計(jì);（3）比較信噪比估計(jì)值與圖像清晰度之間的關(guān)系。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與儀器

本研究課題基于拉曼光譜成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)微弱拉曼光譜成像信息提取及SNR估計(jì)。通過(guò)對(duì)泰諾，替硝銼，頭孢呋辛酯片以及不同曝光時(shí)間細(xì)胞的拉曼數(shù)據(jù)，對(duì)其進(jìn)行拉曼成像，信息提取以及信噪比估計(jì)。本次研究的所有算法程序都通過(guò)MATLAB實(shí)現(xiàn)。

2.2 結(jié)果分析

利用本文算法對(duì)不同藥品和細(xì)胞的拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，下面僅以泰諾和細(xì)胞的拉曼圖像為例。

圖1是曝光時(shí)間為0.03s的細(xì)胞經(jīng)數(shù)據(jù)平滑后的結(jié)果。移動(dòng)平均值和移動(dòng)中值這兩種方法信號(hào)提取效果一般，其中，對(duì)光譜處理圖像基本沒(méi)有變化，對(duì)拉曼圖像直接處理，信號(hào)略微加強(qiáng)。

圖2是掃描時(shí)間為0.3s的泰諾經(jīng)傅里葉變換后的結(jié)果，在傅里葉變換與逆變換之間對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行的是置零處理。無(wú)論是對(duì)拉曼光譜做傅里葉變換或是對(duì)拉曼圖像做傅里葉變換，與其原始圖像相比，結(jié)果均沒(méi)有明顯變化。

接下來(lái)我們用小波函數(shù)coif3對(duì)圖像進(jìn)行3層小波分解。圖3是曝光時(shí)間為0.1s的細(xì)胞經(jīng)小波變換后的結(jié)果，可見(jiàn)，小波變換對(duì)拉曼圖像的去噪效果不明顯，拉曼圖像基本沒(méi)有變化，圖像清晰度并沒(méi)有提升。

泰諾經(jīng)各濾波法處理后的結(jié)果如圖4所示。

由濾波結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)中值濾波與均值濾波處理的拉曼圖像清晰度較其他方法均有明顯改善。為了增大拉曼圖像的清晰度，我們分別通過(guò)這兩種方法先對(duì)拉曼光譜做濾波，再計(jì)算成像數(shù)據(jù)，而后再對(duì)拉曼圖像做濾波，得到最終結(jié)果，即做二次濾波。圖5與圖6為掃描時(shí)間為0.3s的泰諾和曝光時(shí)間為0.03s的細(xì)胞經(jīng)二次濾波后的結(jié)果。

根據(jù)最終得到的圖像，我們發(fā)現(xiàn)二次中值濾波的效果較好，二次均值濾波邊緣效果不佳。因此，我們選取二次中值濾波的結(jié)果進(jìn)行信噪比估計(jì)。

經(jīng)二次中值濾波后三種藥品拉曼圖像的信噪比如表1所示。

根據(jù)信噪比估計(jì)值，結(jié)合二次濾波后的圖像，我們可以發(fā)現(xiàn)信噪比估計(jì)值隨掃描時(shí)間的增加而增大，也就是說(shuō)，圖像信噪比越大，圖像越清晰。并且，當(dāng)泰諾信噪比估計(jì)值大于-17時(shí)，可以清晰成像。替硝銼成像清晰的分界點(diǎn)為曝光時(shí)間為0.3s時(shí)，即當(dāng)信噪比估計(jì)值大于-15.6769時(shí)，可以判定圖像可清晰成像。頭孢呋辛酯片信噪比估計(jì)值的分界線也不夠明顯。但可以大致判斷出當(dāng)其信噪比估計(jì)值大于-22時(shí)，可以較清晰成像。

不同曝光時(shí)間的細(xì)胞的信噪比估計(jì)值如表2所示。比對(duì)不同曝光時(shí)間細(xì)胞的信噪比估計(jì)值與其拉曼圖像，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)曝光時(shí)間大于或等于0.05s時(shí)，細(xì)胞可以清晰成像，因此，當(dāng)其信噪比估計(jì)值大于-43.46時(shí)拉曼成像清晰。

綜上所述，在通過(guò)不同方法對(duì)拉曼圖像處理結(jié)果的比較，對(duì)圖像二次濾波后得到的拉曼圖像更能清晰成像。因此，我們利用不同藥品與不同曝光時(shí)間細(xì)胞經(jīng)二次濾波后的拉曼圖像進(jìn)行信噪比估計(jì)，得到SNR值與圖像清晰度之間的關(guān)系。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，系統(tǒng)信噪比以不同比例線性增加[12]，圖像清晰度也增加。但本文算法的局限性在于得到的SNR估計(jì)值與拉曼圖像關(guān)系不夠緊密，即SNR估計(jì)值反映清晰成像與否的分界不夠明顯。

3 結(jié)語(yǔ)

本文提出了一種對(duì)低信噪比的拉曼圖像的快速成像方法。通過(guò)該算法可先對(duì)局部數(shù)據(jù)進(jìn)行信噪比估計(jì)，根據(jù)SNR估計(jì)值與圖像清晰度之間的關(guān)系，直接選取符合實(shí)驗(yàn)要求的掃描時(shí)間。本文通過(guò)對(duì)不同藥品與細(xì)胞的拉曼成像進(jìn)行信息提取與SNR估計(jì)，建立SNR估計(jì)值與圖像清晰度之間的關(guān)系，達(dá)到快速成像和減噪的目的。

參考文獻(xiàn)

[1] Xin Wang， Hao He， Xianguang Fan.Signal processing for fast Raman imaging under low SNR condition and its applications in Raman imaging[J]. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems.2017，163：41-48.

[2] 韋娜，馮敘橋，張孝芳，等.拉曼光譜及其檢測(cè)時(shí)樣品前處理的研究進(jìn)展[J].光譜學(xué)與光譜分析，2013，33（3）：694.

[3] Jun Ando， Almar F Palonpon， Mikiko Sodeoka and Katsumasa Fujita. High-speed Raman imaging of cellular processes [J].Chemical Biology.2016，（33）：16-24.

[4] 田國(guó)輝，陳亞杰，馮清茂.拉曼光譜的發(fā)展及應(yīng)用[J].化學(xué)工程師，2008，22（1）：34-36.

[5] 王昕，何浩，范賢光，湯明.基于匹配追蹤的拉曼光譜信號(hào)重構(gòu)算法[J].光譜學(xué)與光譜分析，2018，38（1）：93-98.

[6] 夏良平，李華棟，尹韶云，等.基于形狀相似性比較法消除拉曼光譜的復(fù)雜背景噪聲[J].光學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（5）：1-6.

[7] 俞瀟，賈振紅，莫家慶，呂小毅.基于LMS自適應(yīng)的拉曼光譜去噪方法研究[J].激光雜志，2015，36（12）：71-73.

[8] 陶明.羅丹明B拉曼散射檢測(cè)中光譜處理方法與實(shí)驗(yàn)研究[D].湖北工業(yè)大學(xué)，2017.

[9] 徐朝賢.消化系統(tǒng)癌癥患者血清蛋白表面增強(qiáng)拉曼光譜研究[D].福建師范大學(xué)，2016.

[10] 朱自瑩，顧仁敖，陸天虹，等.拉曼光譜在化學(xué)中的應(yīng)用[M].沈陽(yáng)：東北大學(xué)出版社，1998.

[11] 姜承志，孫強(qiáng)，劉英，等.基于多尺度局部信噪比的拉曼譜峰識(shí)別算法[J].光學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（6）：1-7.

[12] 乓華鋒，姚輝璐，楊慶怡，等.激光光鑷?yán)庾V儀信噪比測(cè)量研究[J].物理與工程，2008，18（5）：24-26.