于濤 孫麗麗

摘要：本文探索了高效液相色譜法檢測(cè)人纖維蛋白含量的色譜條件，通過(guò)對(duì)人纖維蛋白溶液紫外光譜的掃描結(jié)果，設(shè)定不同波長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)，并篩選出適合的波長(zhǎng)，為開(kāi)展進(jìn)一步分析提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫外光譜;人纖維蛋白含量;測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)： R927 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ?A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.14.031

高效液相色譜法和氨基酸分析儀是目前蛋白質(zhì)分析方法中最有效的手段，高效液相色譜法分析原理主要是利用蛋白質(zhì)的氨基與標(biāo)識(shí)化試劑作柱前或柱后衍生，再進(jìn)行測(cè)定。目前，用于反相高效液相色譜檢測(cè)氨基酸的柱前衍生試劑近10種，以柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定纖維蛋白原中的精氨酸也有報(bào)道，但其衍生化試劑盒費(fèi)用高，且需配置熒光檢測(cè)器。本實(shí)驗(yàn)參照 《中國(guó)藥典》二部（2005版）中高效液相色譜法，采用2，4-二硝基氟苯為柱前衍生劑，以紫外吸收檢測(cè)器檢測(cè)不同波長(zhǎng)的吸收效果，選出最佳的吸收波長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

人纖維蛋白原為BIOSHARP公司產(chǎn)品，規(guī)格：100mg/支，Exp：2017/03。

1.2 主要試劑及儀器

磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，乙腈（色譜純），凝膠色譜柱Shodex KW-802.5，島津紫外檢測(cè)器，普析TU-1901型紫外分光光度計(jì)。

1.3 流動(dòng)相及樣品溶液的制備

流動(dòng)相采用乙腈-磷酸鹽緩沖溶液，稱(chēng)取磷酸二氫鈉9.5g，磷酸氫二鈉1.25g，置于500mL容量瓶中，超純水溶解并定容，另取500mL乙腈與其混合，用0.45μm有機(jī)膜過(guò)濾。

1.4 樣品處理

精密量取樣品溶液1mL，加入相對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相乙腈-磷酸鹽緩沖液和乙腈-純水溶液99mL，充分混勻，靜止30min，進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，離心5min，取上層清液進(jìn)行測(cè)定。

1.5 色譜條件

采用凝膠色譜柱Shodex KW-802.5（5μm，8*300 mm）;流速1mL/min;波長(zhǎng)設(shè)定為205nm、215nm、230nm、280nm;柱溫40℃;采用島津LC-15C色譜工作站;進(jìn)樣量20μL。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

分別在不同波長(zhǎng)下分析蛋白分子保留時(shí)間及色譜峰吸收強(qiáng)度，篩選最適合的實(shí)驗(yàn)條件。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

掃描紫外光譜，波長(zhǎng)200～350nm，結(jié)果見(jiàn)圖1。

通過(guò)掃描紫外光譜可得出蛋白溶液200～230nm內(nèi)有較強(qiáng)吸收強(qiáng)度，在250～300nm有較弱的吸收強(qiáng)度，故設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm、215nm、230nm、280nm。

不同吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)結(jié)果（流動(dòng)相配比為乙腈：磷酸鹽緩沖液=1：1）。

在波長(zhǎng)為205nm下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由色譜圖結(jié)果可得出，色譜峰的吸收強(qiáng)度不高，各氨基酸組分分離度≤0.5，色譜峰存在一定拖尾現(xiàn)象，分離效果不理想。

在波長(zhǎng)215nm下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由色譜圖結(jié)果可得出，色譜峰的吸收強(qiáng)度較好，各氨基酸組分分離度≥1.5，色譜峰對(duì)稱(chēng)性理想，分離效果較為滿意。

在波長(zhǎng)230nm下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由色譜圖結(jié)果可得出，色譜峰的吸收強(qiáng)度降低，各氨基酸組分分離度≤1，色譜峰對(duì)稱(chēng)性不理想，且蛋白組分比例發(fā)生明顯變化，分離效果不滿意，不建議在此波長(zhǎng)下分析檢測(cè)。

在波長(zhǎng)280nm下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由色譜圖結(jié)果可得出，色譜峰的吸收強(qiáng)度大幅降低，各氨基酸組分分離度≤0.5，色譜峰對(duì)稱(chēng)性很不理想，且蛋白組分無(wú)法分離，此波長(zhǎng)不適合進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的色譜方法采用凝膠色譜柱進(jìn)行分離，通過(guò)多次單因素實(shí)驗(yàn)，確定在215nm波長(zhǎng)下蛋白分子有最佳吸收強(qiáng)度和分離度，通過(guò)對(duì)此次實(shí)驗(yàn)方法條件的摸索，得到最適合吸收波長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，有良好的重復(fù)性，可直接用于人纖維蛋白含量測(cè)定，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：于濤，碩士，中級(jí)講師，研究方向：玉米深加工、儀器分析。