陳慧婧 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

新城疫（Newcastle disease，ND）又名亞洲雞瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起雞的一種以呼吸困難、黏膜及漿膜出血、高熱、下痢、神經(jīng)紊亂為特征的禽類高度接觸性急性傳染病[1]。禽流感 （Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒引起雞、火雞、鴨、鵪鶉和鵝及水禽、野鳥等患病的傳染性疾病，禽流感又被稱為真性雞瘟或歐洲雞瘟[2-3]。新城疫和禽流感是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病毒性疫病，在規(guī)模雞場(chǎng)中?；旌细腥净蚶^發(fā)感染。免疫接種仍然是防控該病的主要措施，雞新城疫-禽流感 （H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗得到了廣泛應(yīng)用。作為滅活疫苗，滅活過程事關(guān)生物安全，滅活不徹底存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)，但加入過量的滅活劑又會(huì)影響疫苗的免疫效果。本試驗(yàn)通過對(duì)兩種抗原用不同濃度的甲醛滅活劑量和不同滅活時(shí)間，檢測(cè)滅活效果和血凝價(jià)變化，篩選出最適合的甲醛滅活濃度和滅活時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 新城疫病毒 （La Sota株） 抗原BS2016005批、禽流感病毒（H9亞型 HP株）抗原BS2016003批，由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 非免雞胚，由揚(yáng)州康威提供，福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行孵化至10日齡。

1.1.3 主要試劑 生理鹽水、青霉素鏈霉素溶液（1萬單位/mL）、1%雞紅細(xì)胞懸液為福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司配制；甲醛溶液為三明市三圓化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 滅活 用37%甲醛溶液滅活，按最終濃度分為①組0.1%甲醛溶液、②組0.2%甲醛溶液、③組0.4%甲醛溶液、④組0.8%甲醛溶液。分別取新城疫抗原和禽流感抗原，用滅菌的四層紗布過濾，去除尿囊液中的雜質(zhì)，將過濾后的抗原準(zhǔn)確稱量后置于滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)。將滅活劑緩緩加入抗原中，邊加邊搖晃使其充分?jǐn)嚢杈鶆颉＜油隃缁顒┖笮栌脺缇啿颊喝缁顒┎潦闷靠诤推款i內(nèi)壁，避免瓶頸附近在抗原接觸不到滅活劑而導(dǎo)致滅活不徹底。充分混勻后置于37℃溫室中，期間每隔4 h搖勻一次，使其溫度均勻，滅活劑和抗原均勻接觸。待抗原達(dá)到37℃開始計(jì)時(shí)，分別在 10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h 取樣。

1.2.2 滅活效果評(píng)價(jià)

1.2.2.1 滅活檢驗(yàn)

1.2.2.1.1 準(zhǔn)備 1 mL注射器（帶5#針頭），標(biāo)記好氣室及接種位的10日齡SPF雞胚12枚。

1.2.2.1.2 消毒 消毒SPF雞胚氣室及腔接種位，并在氣室及接種位上打孔。

1.2.2.1.3 接種 將待檢樣品接種SPF雞胚，每枚胚分別尿囊腔接種待檢滅活胚液0.2 mL，每個(gè)樣品接種12枚SPF雞胚。

1.2.2.1.4 照蛋 24 h后開始照蛋，每天照蛋2次，觀察5 d。

1.2.2.1.5 HA測(cè)定 對(duì)所有胚液分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)。

1.2.2.1.6 判定 雞胚非特異性死亡不應(yīng)超過1枚，雞胚均無血凝出現(xiàn)，認(rèn)為滅活完全。當(dāng)HA結(jié)果有可疑時(shí)，應(yīng)將可疑胚液按上述方法進(jìn)行重檢，重檢不合格則說明滅活不徹底。

1.2.2.2 血凝價(jià)測(cè)定 取各甲醛濃度各滅活時(shí)間的樣品進(jìn)行血凝價(jià)測(cè)定，同時(shí)留取新城疫病毒（La Sota株）抗原BS2016005批和禽流感病毒（H9亞型HP株）BS2016003批滅活前的樣品作對(duì)照。

3 結(jié)果與分析

3.1 滅活檢驗(yàn)

3.1.1 新城疫病毒滅活檢驗(yàn)結(jié)果 新城疫病毒經(jīng)不同濃度甲醛滅活不同時(shí)間的效果見表1。經(jīng)0.1%、0.2%甲醛溶液滅活16 h可以達(dá)到100%滅活效果，0.4%甲醛溶液滅活14 h達(dá)到100%滅活效果，0.8%甲醛溶液滅活10 h病毒全部死亡。從表1雞胚死亡比例可以看出，隨著甲醛濃度增加，病毒滅活速度加快。

表1 新城疫抗原滅活檢驗(yàn)結(jié)果

3.1.2 禽流感病毒滅活檢驗(yàn)結(jié)果 禽流感病毒經(jīng)不同濃度甲醛、滅活不同時(shí)間的效果見表2。經(jīng)0.1%、0.2%甲醛溶液滅活16 h可以達(dá)到100%滅活效果，0.4%甲醛溶液滅活14 h達(dá)到100%滅活效果，0.8%甲醛溶液滅活12 h達(dá)到100%滅活效果。從表2雞胚死亡比例可以看出，隨著甲醛濃度增加，病毒滅活速度加快，病毒全部滅活也隨著甲醛濃度增加而縮短時(shí)間。

表2 禽流感抗原滅活檢驗(yàn)結(jié)果

3.2 不同濃度甲醛對(duì)血凝活性影響

3.2.1 不同濃度甲醛對(duì)新城疫病毒 （La Sota株）血凝活性影響 不同濃度的甲醛滅活新城疫病毒，滅活不同時(shí)間的血凝價(jià)見表3。由數(shù)據(jù)可以看出，新城疫病毒血凝活性受甲醛濃度和滅活時(shí)間影響較大，0.8%濃度的滅活影響最大，10 h時(shí)血凝價(jià)降低了6個(gè)滴度，到16 h時(shí)已經(jīng)沒有血凝活性；0.1%和0.2%相對(duì)接近，18 h前只降低了2個(gè)滴度，到48 h也降低了4～5個(gè)滴度，0.1%比0.2%稍好；0.4%到16 h已經(jīng)降低了4個(gè)滴度，到48 h只剩22。由此可見，新城疫病毒受甲醛濃度和滅活時(shí)間影響很大，濃度越大、時(shí)間越長(zhǎng)，影響越大。

3.2.2 不同濃度甲醛對(duì)禽流感病毒 （H9亞型HP株）血凝活性影響 不同濃度的甲醛滅活禽流感病毒，滅活不同時(shí)間的血凝價(jià)見表4。由數(shù)據(jù)可以看出，禽流感抗原滅活前血凝是29，4組不同濃度及不同時(shí)間的血凝價(jià)全部是28。由此可見，禽流感病毒血凝活性受甲醛濃度和滅活時(shí)間的影響不大。

表3 甲醛對(duì)新城疫病毒血凝活性影響

表4 甲醛對(duì)禽流感病毒血凝活性影響

3 討 論

滅活工序是滅活疫苗生產(chǎn)中最重要、最關(guān)鍵的生產(chǎn)環(huán)節(jié)之一，抗原滅活的效果與滅活劑關(guān)系重大，如果滅活不徹底存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)。甲醛是應(yīng)用最廣泛的滅活劑，其普遍應(yīng)用于動(dòng)物滅活疫苗的生產(chǎn)中。甲醛的濃度、作用時(shí)間、溫度等條件是影響滅活效果和抗原損失的重要因素[4]。滅活疫苗生產(chǎn)中病毒滅活不徹底將造成災(zāi)難性的影響，所以，在滅活時(shí)，有的會(huì)加入超量的滅活劑。田國(guó)斌等認(rèn)為禽流感病毒在滅活時(shí)使用超量的甲醛溶液，病毒的保護(hù)性抗原會(huì)被破壞，對(duì)免疫效果會(huì)造成不良影響[5]。有關(guān)試驗(yàn)證明疫苗中血凝素的含量與免疫后的抗體水平和攻毒保護(hù)率有密切關(guān)系。所以，本試驗(yàn)對(duì)兩種抗原用不同濃度的甲醛和不同的時(shí)間進(jìn)行滅活研究，觀察不同濃度甲醛對(duì)病毒的滅活效果以及對(duì)血凝活性的影響。

新城疫病毒經(jīng)0.1%和0.2%甲醛滅活16 h，病毒全部死亡；0.4%和0.8%甲醛分別在14 h和10 h病毒全部死亡。而新城疫病毒的血凝活性對(duì)甲醛比較敏感，0.8%甲醛濃度到16 h已經(jīng)沒有血凝價(jià)，0.4%濃度也使血凝價(jià)下降很多，到16 h已經(jīng)下降了4個(gè)滴度，到48 h只剩22，0.1%和0.2%甲醛濃度在18 h前血凝價(jià)只降低2個(gè)滴度，隨著時(shí)間延長(zhǎng)到48 h也降低了4～5個(gè)滴度。田國(guó)斌等認(rèn)為甲醛濃度的高低直接影響雞只接種部位的刺激和損傷大小，從而影響疫苗的吸收和免疫效果[5]。在保證病毒全部被滅活的前提下，選擇甲醛含量盡量低、血凝活性盡量高、滅活時(shí)間盡量短的條件。從試驗(yàn)結(jié)果得出，新城疫病毒最適合的甲醛濃度為0.1%，滅活時(shí)間為16 h。

禽流感病毒經(jīng)0.1%和0.2%甲醛滅活16 h，病毒全部死亡；0.4%和0.8%甲醛分別在14 h和12 h病毒全部死亡。禽流感病毒的血凝活性受甲醛影響不大，滅活前血凝活性為29，而4個(gè)濃度的不同滅活時(shí)間，血凝活性全部為28，經(jīng)過滅活只下降了1個(gè)滴度。從試驗(yàn)結(jié)果得出，禽流感病毒用0.1%甲醛濃度進(jìn)行滅活16 h，病毒全部死亡，但是禽流感病毒很容易變異，為確保滅活效果，批量生產(chǎn)時(shí)可將禽流感病毒滅活時(shí)間定為18 h。