蔣雪薇 李 浩 熊久松 鄧建陽(yáng)， 徐歡歡 姚 力 羅曉明*

（1 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院 長(zhǎng)沙410114 2 湖南益陽(yáng)皇爺食品有限公司 湖南益陽(yáng)413000）

檳榔是一種地方特色小食品， 國(guó)內(nèi)主產(chǎn)于海南，加工地主要在湖南[1]。 現(xiàn)代食用檳榔食品起源于湖南省湘潭市，在上世紀(jì)90年代開始使用現(xiàn)代化方法組織加工和生產(chǎn)， 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展成為一種遍布湖南全省并不斷向全國(guó)擴(kuò)散的休閑食品[2-3]。目前，湖南檳榔食品年產(chǎn)值達(dá)到300 億，占全國(guó)檳榔食品總產(chǎn)值的四分之三， 是湖南食品行業(yè)中極具特色的產(chǎn)業(yè)之一。 產(chǎn)于海南的檳榔鮮果經(jīng)干制后制成原籽運(yùn)至湖南加工，根據(jù)原籽的貯藏時(shí)間，將當(dāng)年處理得到的原籽稱為新籽， 而貯藏1年及以上的原籽稱為老籽。 由于檳榔成果時(shí)內(nèi)生菌以及運(yùn)輸貯藏條件的影響，所以無論新籽還是老籽，在其貯藏過程中會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)霉的現(xiàn)象， 而霉變的檳榔原籽不能進(jìn)入后續(xù)加工環(huán)節(jié)。 大面積的霉變往往造成加工企業(yè)的重大損失。為減少原料損失，檳榔加工企業(yè)開始研究原籽的防霉。 分析原籽中霉菌的群落結(jié)構(gòu)，從而得出原籽中霉菌污染途徑，是設(shè)計(jì)有效防控方案的基礎(chǔ)， 因此研究檳榔原籽中污染霉菌的基本信息對(duì)檳榔原籽防霉技術(shù)研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義[4-5]。

由于檳榔食品的地域局限性， 所以關(guān)于其污染菌的研究較少， 且多采用傳統(tǒng)的菌種分離及鑒定方法為主，所得菌群信息較少且準(zhǔn)確程度不高。銀波[6]、文大綴等[7]通過霉菌形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)原籽及生產(chǎn)過程中優(yōu)勢(shì)霉菌分別為青霉及毛霉； 徐遠(yuǎn)芳等[8]通過ITS 序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)成品檳榔中兩種主要污染霉菌分別為類棒菌狀紅球菌（Rhodococcus corynebacterioides）和黃曲霉（Aspergillus flavus）。近幾年運(yùn)用較多的分子生物學(xué)方法， 如變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE）[9]、溫度梯度凝膠電泳技術(shù)和基因文庫(kù)法則未見報(bào)道。 高通量測(cè)序（HTS）技術(shù)是近幾年基因組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的測(cè)序技術(shù)， 其對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的研究具有明顯的先進(jìn)性和優(yōu)勢(shì)， 能對(duì)不同菌群進(jìn)行準(zhǔn)確定量及實(shí)時(shí)檢測(cè)。目前，高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛運(yùn)用于腸道及土壤等樣品的菌群多樣性分析等多個(gè)領(lǐng)域[10-13]。 近期，高通量測(cè)序技術(shù)也開始運(yùn)用于紅酒、奶酪等較復(fù)雜的微生物發(fā)酵體系的研究[14-17]。本文利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同檳榔原籽的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究， 建立一套適用于固體食品物料的高通量測(cè)序方法，并獲得檳榔貯藏中污染微生物分類信息，從而了解其污染源， 為檳榔生產(chǎn)微生物污染防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檳榔原籽樣品采自某檳榔公司，產(chǎn)地海南，包括當(dāng)年產(chǎn)的檳榔原籽新籽（BL1）及貯藏超過1年的原籽老籽（BL2）。

E.Z.N.A.Soil DNA Kit，美國(guó)Omega 生物試劑公司；Taq DNA Polymerase 及dNTP-mix， 美國(guó)Thermo Fisher 科技公司；Qubit2.0 檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Life 科技公司；SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒，上海生工；瓊脂糖，北京天根生化科技有限公司。

引物為真菌18S 通用引物， 由上海生工生物工程有限公司提供合成： 上游引物NS1[18]（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）， 下游引物FUNGAL[19]（5′-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3′）。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21 臺(tái)式離心機(jī)， 美國(guó)Thermo Fisher 科技公司；GL-88B 漩渦混合器， 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H 混勻型干式恒溫器，深圳拓能達(dá)科技；DYYY-6C 電泳儀電源，北京市六一儀器廠型；DYCZ-21 電泳槽， 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)ChampGel5000（增強(qiáng)型），北京賽智公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增 采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit 試劑盒提取檳榔中微生物總DNA，然后用Qubit2.0 檢測(cè)DNA 的濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性，置于-20 ℃?zhèn)溆?。選用通用引物NS1-FUNGAL 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s；35 個(gè)循環(huán)， 最終72 ℃延伸5 min。PCR 結(jié)果于1%瓊脂糖凝膠上電泳，EB 染色，凝膠成像觀察，擴(kuò)增效果較好。

1.3.2 PCR 產(chǎn)物純化及定量 采用生工瓊脂糖回收試劑盒對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，然后按照PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)方法檢測(cè)?；厥债a(chǎn)物用Qubit2.0 檢測(cè)試劑盒定量。

1.3.3 高通量測(cè)序 利用Qubit2.0 DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA 精確定量， 根據(jù)測(cè)得的DNA濃度，將所有樣品按照1∶1 的比例進(jìn)行混合；混合后充分振蕩均勻， 然后利用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 QIIME[20]軟件數(shù)據(jù)分析 首先采用Flash 軟件融合雙末端序列，而后通過各樣品barcode 使數(shù)據(jù)回歸樣品，并使用Prinseq 軟件對(duì)各樣本序列做質(zhì)量控制（Quality Control，QC）除去引物序列、短片段、 低復(fù)雜度序列和低質(zhì)量序列。 再利用pre.cluster 軟件去除非靶區(qū)域序列及嵌合體以獲得可供分析的序列。

在對(duì)序列預(yù)處理完成后， 采用uclust 軟件對(duì)其進(jìn)行OTU 聚類。 即將多條序列根據(jù)其序列之間的距離來對(duì)它們進(jìn)行聚類， 序列相似性大于97%的定位為一個(gè)OTU。最后根據(jù)樣品的OTU 及序列關(guān)系，采用mothur[21]軟件對(duì)樣品Alpha 多樣性分析，計(jì)算各種物種多樣性指數(shù)，衡量樣本物種多樣性。

采用軟件RDP classifier 將序列進(jìn)行物種分類，RDP classifier 運(yùn)行參數(shù)：-f allrank-q input-g 18s-o rdp_out，分類閾值默認(rèn)為0.8。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

將兩個(gè)樣品混合測(cè)序， 以barcode 序列為標(biāo)簽，進(jìn)行真菌測(cè)序。測(cè)序引物設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為310bp 左右。測(cè)序結(jié)束后，以barcode 對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行區(qū)分，BL1 樣本獲得序列數(shù)為42 702， 而BL2 樣本獲得序列數(shù)為40 953。 在進(jìn)行QC 之后，序列長(zhǎng)度大部分分布在300～400 之間，平均長(zhǎng)度均在為309.6bp左右， 兩個(gè)樣品的有效序列長(zhǎng)度分布詳細(xì)結(jié)果見圖1。 再經(jīng)過去除嵌合體及靶區(qū)域外序列后，最終獲得BL1 樣本可用于分析的序列數(shù)為42 099，BL2 樣本可用于分析的序列數(shù)為40 791， 符合基本分析要求。

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 OTU 統(tǒng)計(jì)分類 兩個(gè)樣品通過uclust 軟件聚類最終總共獲得1 084 個(gè)OTUs 分類，其中BL1有799 個(gè)，而BL2 有515 個(gè)。總樣品和各個(gè)樣品檳榔真菌門類OTU 分布如圖2 所示。為了驗(yàn)證OTU分類能否真實(shí)地反映原始樣品的微生物群落的多樣性，對(duì)不同檳榔原籽菌群的多樣性利用richness rarefaction 進(jìn)行評(píng)估。兩個(gè)樣品的稀釋性曲線均相對(duì)趨于平穩(wěn)（圖3），說明取樣合理，測(cè)序量能夠真實(shí)反映原始樣品的微生物群落的多樣性。

圖1 有效序列長(zhǎng)度分布圖Fig.1 Available sequences length distribution

圖2 樣品OTU 分類Fig.2 OTU classification

圖3 樣品豐度稀釋性曲線Fig.3 Richness rarefaction of sample

2.2.2 真菌菌群Alpha 多樣性分析 采用香農(nóng)指數(shù)（Shannon Index）與Chao1 指數(shù)作為兩個(gè)樣品α多樣性的分析指標(biāo)。 由Shannon 曲線 （圖4）和Chao1 曲線（圖5）可以看出，BL1 樣品的Shannon指數(shù)及Chao1 指數(shù)均高于BL2 樣品，說明BL1 樣品的空間異質(zhì)性及物種豐富度都較BL2 樣品更高， 即檳榔原籽新籽在相同質(zhì)量下具有更多的微生物物種共存。同時(shí)這也表明，檳榔原籽新籽中部分微生物并不能適應(yīng)檳榔干果的環(huán)境， 從而在倉(cāng)庫(kù)貯藏過程中漸漸死亡。

圖4 香農(nóng)指數(shù)稀疏性曲線Fig.4 Shannon index rarefaction

圖5 Chao1 指數(shù)圖Fig.5 Chao1 Index

2.3 物種分類及鑒定

從圖6 可以看出，在“科”的分類水平上，檳榔新籽中占主導(dǎo)地位的為發(fā)菌科（Trichocomaceae）、占92.49%，節(jié)擔(dān)菌科（Wallemiaceae）占1.29%，刺革菌科（Hymenochaetaceae）占0.73%，其他如酵母科（Saccharomycetaceae）、盾藻衣科（Lichinaceae）等極少，加上未分類序列占5.79%。 而檳榔老籽中基本上全部為發(fā)菌科（Trichocomaceae），占98.78%，其他如節(jié)擔(dān)菌科（Wallemiaceae）、刺革菌科（Hymenochaetaceae）、酵母科（Saccharomycetaceae）等加上未分類序列僅占1.22%。 通過對(duì)比可以看出，兩種檳榔原籽在family 水平上優(yōu)勢(shì)菌均為發(fā)菌科（Trichocomaceae），同時(shí)，在貯藏過程中，節(jié)擔(dān)菌科（Wallemiaceae）、刺革菌科（Hymenochaetaceae）、酵母科（Saccharomycetaceae）等所占比例減少。

從圖7 可以看出，在“屬”的分類水平上，檳榔原籽新籽中以發(fā)菌科下的散囊菌屬（Eurotium）、根霉屬（Rhizopus）及曲霉屬（Aspergillus）為主要的污染真菌，分別占96.03%、2.18%和0.82%。 其它如節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、纖孔菌屬（Inonotus）、酵母菌屬（Saccharomyces）與亥普衣屬（Heppia）等也少量存在。 而在貯藏了1年的檳榔原籽老籽卻是以發(fā)菌科下的曲霉屬 （Aspergillus）與散囊菌屬（Eurotium）為主要污染真菌， 兩者所占比例分別為94.57%和4.89%。 其它只有纖孔菌屬（Inonotus）含量超過0.1%。 而在新籽中存在的根霉屬（Rhizopus）則并未被檢出。

圖6 科水平的物種豐度圖Fig.6 Species richness at family level

圖7 屬水平的物種豐度圖Fig.7 Species richness at genus level

2.4 討論

從整體上看， 檳榔原籽污染真菌均為能利用木質(zhì)纖維的植物內(nèi)生菌。 結(jié)合兩個(gè)樣品α 多樣性分析及其物種分類鑒定結(jié)果可以看出， 檳榔原籽在貯藏過程中， 如根霉屬 （Rhizopus）及青霉屬（Penicillium）等[22]在低水活度對(duì)木質(zhì)纖維利用能力較差的真菌會(huì)因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏而減少甚至消失?？梢酝茰y(cè)，這幾種新籽中的污染真菌可能來源于檳榔鮮果采摘后的干燥處理及運(yùn)輸過程。 而散囊菌屬（Eurotium）[23]及曲霉屬（Aspergillus）等在低水活度下對(duì)于也能利用木質(zhì)纖維的真菌則同時(shí)存在于檳榔原籽的新籽和老籽， 僅豐度比例因種間競(jìng)爭(zhēng)而出現(xiàn)了差異性， 分析這些污染菌可能為檳榔鮮果的內(nèi)生菌。

檳榔原籽真菌污染不僅會(huì)增加原籽貯藏成本，同時(shí)也會(huì)增加后續(xù)工序滅菌難度，造成檳榔成品的污染。因此，通過適當(dāng)?shù)奶幚砑夹g(shù)可以減少鮮果中內(nèi)生菌，同時(shí)，在鮮果加工成原籽及原籽運(yùn)輸?shù)倪^程中注意減少與環(huán)境微生物的接觸， 能有效減少原籽中真菌污染。

3 結(jié)論

檳榔原籽貯藏過程中， 檳榔污染真菌物種多樣性會(huì)隨著時(shí)間的變化而降低。 兩個(gè)樣品的污染真菌主要分布于發(fā)菌科（Trichocomaceae）、節(jié)擔(dān)菌科（Wallemiaceae）和刺革菌科（Hymenochaetaceae）等5 個(gè)科，19 個(gè)屬，發(fā)菌科為優(yōu)勢(shì)菌科。 而在“屬”的分類水平上，新籽、老籽兩種樣品則分別為散囊菌屬（Eurotium）和曲霉屬（Aspergillus）。 根據(jù)優(yōu)勢(shì)菌群的特點(diǎn)， 可以判斷檳榔原籽中大部分霉菌為內(nèi)生菌。 檳榔成果時(shí)的內(nèi)生霉菌在檳榔鮮果干制成原籽后還有較高的存活率， 這對(duì)檳榔產(chǎn)品的微生物指標(biāo)有較大的影響， 如何降低檳榔鮮果內(nèi)生霉菌將是今后檳榔加工防霉研究的重點(diǎn)。