張 杰，周雪清，周心怡，劉文慧，劉倩倩，駱耐香

0 引 言

Chemerin又稱維甲酸受體應(yīng)答子蛋白2是由白色脂肪組織分泌的一種趨化蛋白，可作為G蛋白耦聯(lián)受體趨化因子樣受體1的配體，在適應(yīng)性免疫和固有免疫中均發(fā)揮作用［1-2］。此外Chemerin在肥胖、炎癥反應(yīng)、代謝綜合征、心血管疾病、銀屑病、非酒精性脂肪性肝病和多囊卵巢綜合征等多種病理生理過程中發(fā)揮作用［3-6］。臨床應(yīng)用方面，組織Chemerin水平已被確定為急性髓系白血病診斷和預(yù)后可行的生物學(xué)標志物，其特異性和敏感性分別為79%和54%［7］。在腎上腺皮質(zhì)癌中，血清Chemerin水平也被認定為是一種預(yù)后因子［8］。研究顯示在乳腺癌細胞表面有Chemerin受體表達［9］。然而，目前對于Chemerin是否能在乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮作用尚未見報道。因此，本研究以檢測乳腺癌荷瘤小鼠外周血和乳腺組織中Chemerin蛋白的表達水平，以及其對乳腺癌細胞的增殖和遷移的影響為目的，探討Chemerin對乳腺癌的作用及其能否應(yīng)用于乳腺癌的診斷和預(yù)后檢查提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級6～8周齡雌性Balb/c小鼠18～22 g，30只，實驗動物許可證號：SCXK 湘 2016-0002，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)于透明的塑料籠子中，每天安排12 h：12 h光/暗周期，溫度25℃，濕度70%，通風(fēng)、光照良好，飼料、飲水及時添加，墊料每天更換。

1.1.2 細胞系自中科院上海細胞庫訂購小鼠乳腺癌細胞株4T1以及人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231。

1.1.3 實驗主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶為美國Gibco公司生產(chǎn)；胎牛血清（FBS）購自美國Hyclon公司；人Chemerin重組蛋白（貨號：300-66-25）購自美國Peprotech公司；Chemerin中和抗體（兔源，貨號：BS-10410R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；青霉素、鏈霉素、MTT試劑盒和高效RIPA組織/細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；Chemerin ELISA試劑盒（貨號：ab204520）購自Abcam公司；鼠抗鼠β-actin抗體、辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）和辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。倒置顯微鏡為奧林巴斯公司產(chǎn)品；分光光度計和凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)4T1細胞與MDA-MB-231細胞采用含10%FBS、1 000 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基，MCF-7細胞采用含10%FBS、1000 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.2.2 小鼠乳腺癌模型構(gòu)建收集對數(shù)生長期4T1細胞，制備成單細胞懸液，將其接種于15只小鼠的第4對乳腺皮下，每只小鼠接種癌細胞的數(shù)量為1×105個/100 μL，共接種1次；在另外15只小鼠的相同部位注射等量的等滲鹽水作為對照組。使用游標卡尺分別測量腫瘤的長徑和短徑，當(dāng)達到2 mm×2 mm，并且對照組無瘤狀物形成時，可判斷為小鼠乳腺癌造模成功。

1.2.3 ELISA檢測乙醚麻醉后采用眼球取血收集小鼠外周血，靜置0.5 h，900×g離心15 min，吸取上層血清；手術(shù)分別分離荷瘤小鼠和對照組小鼠第4對乳腺，稱量30 mg乳腺組織放入300 μL高效RIPA組織/細胞裂解液中，超聲破碎，靜置0.5 h，4℃，13800×g，離心20 min，收集上清液。ELISA檢測血清和上清液中Chemerin蛋白的濃度，具體操作步驟依據(jù)試劑盒使用說明進行。

1.2.4 Western blot檢測手術(shù)分別分離荷瘤小鼠和對照組小鼠第4對乳腺，稱量30 mg乳腺組織放入300 μL高效RIPA組織/細胞裂解液中，超聲破碎，靜置0.5 h，4 ℃，13 800×g，離心20 min，收集上清液。將提取的總蛋白進行電泳，分離不同分子量蛋白，再轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗滌。而后孵育兔抗鼠Chemerin抗體（1∶500）、鼠抗鼠β-actin抗體（1∶2000），4℃過夜，二抗室溫孵育1 h。ECL法底物顯色，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）分析所得條帶灰度值，以Chemerin灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值來表示蛋白質(zhì)的相對含量。

1.2.5 MTT 法 檢 測通 過 1、10、100 μg/L 的Chemerin重組蛋白檢測Chemerin是否促進乳腺癌的發(fā)展，結(jié)果顯示100μg/L的Chemerin重組蛋白促進作用最明顯，并采用100μg/L的Chemerin中和抗體進行反向驗證。將對數(shù)生長期MDA-MB-231與MCF-7乳腺癌細胞以5×103個/200 μL分別接種于96孔板，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱無菌培養(yǎng)24 h，將接種的細胞分組參照文獻［10］：空白對照組（只含高糖1640或DMEM培養(yǎng)基，無細胞）、Chemerin重組蛋白組（100 μg/L，無血清培養(yǎng)基進行稀釋）以及Chemerin中和抗體組（100 μg/L，無血清培養(yǎng)基進行稀釋），每組設(shè)置3個復(fù)孔，按順序加入相對應(yīng)的藥物，培養(yǎng)24 h。向每孔中加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h。用1mL注射器吸去廢液，每孔加入150 μL DMSO，搖床振蕩30 min，酶標儀檢測各孔490 nm處吸光度A值［11-12］。

1.2.6 劃痕實驗檢測將對數(shù)生長期MDA-MB-231乳腺癌細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，將其分組為對照組、Chemerin重組蛋白組（100 μg/L）以及Chemerin中和抗體組（100 μg/L），過夜培養(yǎng)。細胞鋪滿后，用10 μL移液器槍頭沿直尺在每孔劃痕，用PBS沖洗細胞劃痕3次，去除漂浮細胞碎片，分別加入含有對應(yīng)蛋白的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱無菌培養(yǎng)。于48 h進行拍照，并測量各劃痕的寬度。細胞遷移能力以遷移率表示，公式如下［13-14］：

細胞遷移率=（原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度）/原劃痕寬度×100%

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均值±標準差（xˉ±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌荷瘤小鼠外周血與乳腺組織中Chemerin蛋白表達量的變化ELISA結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，荷瘤小鼠的外周血與乳腺組織中Chemerin蛋白的表達量均明顯增高（P＜0.05），見表1。Western blot結(jié)果顯示，荷瘤小鼠的乳腺組織中Chemerin蛋白的表達量（1.561±0.133）亦明顯高于正常小鼠（0.910±0.035），差異就有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

表1 小鼠外周血和乳腺組織中Chemerin蛋白表達水平（xˉ±s，pg/mL）Table 1 Chemerin expression level in peripheral blood and mammary gland of mice（xˉ±s，pg/mL）

圖1 Western blot檢測小鼠乳腺組織中Chemerin蛋白表達水平Figure 1 Detection of chemerin expression in mammary gland of mice by western blot

2.2 Chemerin重組蛋白對乳腺癌細胞的增殖和遷移的影響MTT法和劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，Chemerin重組蛋白組MCF-7、MDA-MB-231細胞增殖率和MDA-MB-231細胞的遷移率明顯增加（P＜0.01）；Chemerin中和抗體組均降低（P＜0.05）。見表2。

表2 Chemerin重組蛋白對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響（xˉ±s,%）Table 2 Effect of Chemerin neutralizing Antibody on proliferation of breast cancer cells（xˉ±s,%）

3 討 論

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，在我國乳腺癌的總發(fā)病率以每年2%～5%的速率增長，已成為我國女性癌癥死亡的主要原因之一［15-16］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與表觀遺傳學(xué)修飾等因素相關(guān)，乳腺癌的精準治療逐漸開始發(fā)展［17-18］。研究表明，脂肪組織除了作為能量儲存組織之外，還是重要的內(nèi)分泌組織，其分泌的細胞因子統(tǒng)稱為脂肪因子，包括瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和Chemerin等［19］，其中瘦素、抵抗素等脂肪因子與乳腺癌關(guān)系密切，它們均可促進乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展［20-22］。Chemerin是一種相對分子質(zhì)量為18 000的無活性前蛋白，以自分泌或旁分泌的形式分泌，通過絲氨酸蛋白酶水解切除蛋白的C端部分，生成相對分子質(zhì)量為16 000的活性趨化蛋白［23］。已知血清Chemerin表達水平與胃癌、肺癌、食管鱗狀細胞癌等多種腫瘤的TNM分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并對腫瘤細胞的增殖與遷移起促進作用［24-26］，也與結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈線性相關(guān)［27-28］。

本研究結(jié)果顯示，與對照組正常小鼠相比較，實驗組荷瘤小鼠的外周血與乳腺組織中Chemerin蛋白的表達水平均有明顯的升高，表明Chemerin在乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。同時細胞實驗結(jié)果顯示，與對照組相比較，經(jīng)由不同濃度的Chemerin重組蛋白處理的乳腺癌細胞后，細胞的增殖與遷移能力均得到提升，濃度越大增殖和遷移能力越強，表明促進乳腺癌細胞增殖和遷移具有濃度依賴性。而經(jīng)由Chemerin中和抗體處理的乳腺癌細胞的增殖與遷移能力則受到抑制。由此表明，Chemerin對乳腺癌細胞的增殖與遷移均發(fā)揮了促進作用，而且其促進作用與Chemerin蛋白的濃度呈濃度依賴性。

在本研究中，明確了Chemerin在乳腺癌個體體內(nèi)的表達水平明顯高于正常對照，以及Chemerin可有效促進乳腺癌細胞的增殖和遷移，但Chemerin在乳腺癌發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮作用的機制并未涉及。有文獻顯示，Chemerin發(fā)揮作用的途徑可能是通過JNK與ERK1/2信號通路，以及與促進單核細胞浸潤和分化為巨噬細胞相關(guān)［10，29］。Chemerin對乳腺癌發(fā)揮的促進作用是否與上述機制一致，本課題組還將繼續(xù)開展進一步的研究。本研究結(jié)果為Chemerin成為一個乳腺癌篩查指標應(yīng)用于臨床診斷提供了實驗依據(jù)。