田 勇，郅 琦，李福香，李富華,2，趙吉春,2，曾凱芳,2，明 建,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

兩色金雞菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）屬于菊科（Compositae）金雞菊屬（Coreopsis），是一種廣泛分布于世界各地的小型、無毛、芳香類一年生草本植物[1]。在中國(guó)，因其生長(zhǎng)在新疆南部海拔3 000 m以上的喀喇昆侖山脈常年積雪高山區(qū)域而被當(dāng)?shù)厝朔Q為“昆侖雪菊”或“昆侖雪茶”。它的干燥花蕾被稱為昆侖胎菊（C. tinctoria buds），不僅用作花茶類飲料，還用作維傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中治療高血壓和高脂血癥的民間藥物[2-3]。植物化學(xué)研究表明，雪菊含有多種生物活性物質(zhì)，包括黃酮類、酚類、苯丙素類、聚乙炔糖苷和甾醇等，其中黃酮類化合物含量最為豐富，是其主要的功能活性成分[2,4-5]。目前，國(guó)內(nèi)外研究者們對(duì)雪菊黃酮類化合物的提取條件和工藝進(jìn)行了部分研究，初步判斷出其主要黃酮類物質(zhì)包括總黃酮、水溶性黃酮、原花青素等[6-8]。昆侖胎菊在日常生活中主要作為花茶沖泡飲用，所以其水溶性黃酮的提取及功能活性研究更加值得關(guān)注。

沙愛龍等[9]研究發(fā)現(xiàn)雪菊黃酮可顯著減緩動(dòng)物腦和器官的萎縮和退化過程，促進(jìn)新陳代謝，提高免疫功能，證明其具有抗衰老功能。Zhang Weixin等[10]研究發(fā)現(xiàn)雪菊水提取物顯著提高D-半乳糖致衰老小鼠體內(nèi)的抗氧化防御功能，從而延緩衰老。以上研究表明，昆侖雪菊黃酮具有良好的抗衰老作用，但對(duì)其作用機(jī)制研究尚不深入。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性核組蛋白去乙酰化酶，參與多種生理過程的調(diào)節(jié)，包括衰老、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期、新陳代謝、應(yīng)激條件下的細(xì)胞存活等[11-12]。p53是一種腫瘤抑制因子，可被許多應(yīng)激物激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯或衰老，在衰老過程中也起著重要作用[13-14]。研究表明，SIRT1的激活對(duì)衰老調(diào)節(jié)因子p53有明顯的抑制作用，從而減少細(xì)胞凋亡，延緩衰老[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)以干燥昆侖胎菊為原料，利用水浸提其水溶性黃酮，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化浸提工藝。同時(shí)，通過D-半乳糖致衰老小鼠模型，探討優(yōu)化工藝提取條件下制備的昆侖胎菊水溶性黃酮（C. tinctoria buds water soluble flavonoids，CBF）對(duì)衰老小鼠肝組織SIRT1、p53表達(dá)的影響，以期為深入研究昆侖胎菊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及保健功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動(dòng)物

昆侖胎菊由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院提供，并經(jīng)主任醫(yī)師趙生俊鑒定。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜級(jí)）、D-半乳糖（分析純）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；SIRT1抗體、p53抗體 美國(guó)Proteintech公司；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、抗兔二抗武漢賽維爾生物科技有限公司；乙醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3均為國(guó)產(chǎn)分析純。

60 只SPF級(jí)昆明小鼠（雌雄各半，（20±2）g）購(gòu)于重慶市中藥研究院，動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK（渝）2017-003。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；VIS-722紫外-可見分光光度計(jì) 上海精科科學(xué)儀器有限公司；FA1004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；DF8517超低溫冷凍儲(chǔ)存箱（-80 ℃） 韓國(guó)Ilshin公司；RM2016病理切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司；HI1220烤片機(jī) 德國(guó)LEICA公司；DYCZ-24DN雙垂直電泳儀 北京六一儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮提取量的測(cè)定

參照吳瑛等[17]的方法進(jìn)行。以蘆丁制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品11.2 mg，置于50 mL容量瓶中，加適量體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，水浴加熱使之溶解，并定容至刻度，即得到0.224 mg/mL的對(duì)照品溶液。移取對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至6 mL。加入1 mL的50 g/L NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min；加入1 mL的100 g/L Al(NO3)3溶液，搖勻后靜置6 min；加入10 mL的40 g/L NaOH試液，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后靜置15 min。以不加樣品溶液為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=0.012 6X-0.006 1（R2=0.999 6）。在蘆丁質(zhì)量濃度0～53.76 μg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

總黃酮提取量的測(cè)定：移取1 mL適當(dāng)稀釋倍數(shù)的樣品溶液，加蒸餾水至6 mL，以不加樣品溶液為空白，按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟處理后，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)得吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，并按下式計(jì)算昆侖胎菊水提取液中總黃酮提取量：

式中：C1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算的黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；N1為稀釋倍數(shù)；V1為樣品溶液總體積/mL；m1為樣品質(zhì)量（干基）/g。

1.3.2 CBF提取的單因素試驗(yàn)

采用水溶劑提取法提取昆侖胎菊中水溶性黃酮類化合物，稱取3 g昆侖胎菊（干質(zhì)量），固定其他條件，分別考察水提時(shí)間（2、5、8、11、14、17 min）、水提溫度（75、80、85、90、95、100 ℃）、液料比（50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1（mL/g））3 個(gè)因素對(duì)昆侖胎菊總黃酮提取量的影響。

1.3.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以水提時(shí)間、水提溫度、液料比為自變量，提取液中總黃酮提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析，優(yōu)化CBF提取條件。各因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)自變量因素與水平Table 1 Independent variable and levels used in response surface analysis

1.3.4 CBF的高效液相色譜分析

1.3.4.1 色譜條件

參照Liang Qian等[18]的方法，稍作修改。采用BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈、B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液；流速0.7 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃；LC-20A二極管陣列檢測(cè)器；色譜數(shù)據(jù)在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。梯度洗脫程序如表2所示。

表2 高效液相色譜洗脫條件Table 2 Elution conditions for HPLC

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

準(zhǔn)確稱取綠原酸、黃諾馬苷、兒茶素、花旗松素和馬里苷標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg，用色譜甲醇溶解并分別定容于5 mL棕色容量瓶中，配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并稀釋成不同質(zhì)量濃度溶液（0、10、40、70、100、200、400 μg/mL），經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，備用。按照上述的色譜條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），以峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到回歸方程：y綠原酸=24 279x-99 047，R2=0.999 1；y黃諾馬苷=17 868x-72 736，R2=0.999 2；y兒茶素=16 162x-53 422，R2=0.999 3；y花旗松素=29 328x-75 521，R2=0.999 5；y馬里苷=10 549x-18 026，R2=0.999 5；在0～400 μg/mL線性關(guān)系良好。結(jié)果以干質(zhì)量表示（mg/g）。

1.3.5 動(dòng)物分組與給藥

用于動(dòng)物模型給藥處理的CBF濃縮制備：稱取10 g干燥昆侖胎菊，按照響應(yīng)面優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝條件提取3 次，每次提取液過濾后合并濾液。在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，真空冷凍干燥成棕褐色粉末。按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定其總黃酮含量占（35.27±1.81）%。用藥處理時(shí)用滅菌生理鹽水溶解稀釋到相應(yīng)的黃酮濃度。參考Zhang Weixin等[10]的方法建立衰老小鼠模型，小鼠隨機(jī)分為5 組，每組12 只，除正常對(duì)照組外，其余4 組每日頸背部皮下注射D-半乳糖（無菌生理鹽水溶解，300 mg/（kg·d）），連續(xù)造模45 d。每日D-半乳糖造模后，每組分別進(jìn)行給藥灌胃處理，小鼠分組及給藥情況如表3所示。小鼠體質(zhì)量每隔7 d稱量一次。

表3 各組小鼠的基本給藥情況Table 3 Animal grouping and administration protocol

1.3.6 小鼠一般行為學(xué)的觀察及肝組織樣品的制備

造模給藥期間每天觀察并記錄各組小鼠的一般行為學(xué)變化，包括進(jìn)食、皮膚、毛色、活動(dòng)和精神等情況。小鼠造模45 d后，禁食不禁水24 h，頸椎脫臼處死，迅速摘取小鼠肝臟組織，用預(yù)凍4 ℃滅菌生理鹽水分別洗凈淤血。將肝組織分為2 份，一份固定在福爾馬林中，用于制備石蠟切片（4 μm）；另一份液氮凍存于-80 ℃冰箱，用于測(cè)定衰老相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.3.7 肝組織切片的制作及病理學(xué)形態(tài)觀測(cè)

新鮮肝組織→放入10%福爾馬林試劑固定24 h→分別經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%、85%、90%、95%乙醇溶液脫水處理4、2、2、1 h→無水乙醇I 30 min→無水乙醇II 30 min→醇苯5～10 min→二甲苯I 5～10 min→二甲苯II 5～10 min→石蠟包埋組織塊→石蠟切片機(jī)切片厚4 μm→烤片→石蠟切片脫蠟復(fù)水→蘇木素染液染3～5 min→分化液分化→返藍(lán)液返藍(lán)→流水沖洗→切片依次入體積分?jǐn)?shù)85%、95%的梯度乙醇脫水各5 min→入伊紅染液中染色5 min→切片依次放入無水乙醇I、II、III和二甲苯I、II各5 min→中性樹膠封片→顯微鏡鏡檢（×200），圖像采集分析[19]。

1.3.8 肝組織中SIRT1、p53蛋白表達(dá)水平

采用Western blot法測(cè)定。稱取適量肝組織，加入蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液，徹底勻漿，離心，提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加熱使之變性，每個(gè)蛋白樣品等量（30 μg）進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉1 h后，加入稀釋一抗（SIRT1、p53）4 ℃孵育過夜，TBST洗3 次，加二抗（TBST稀釋3 000 倍）室溫下孵育30 min，TBST洗3 次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影曝光，掃描記錄，采用alphaEaseFC軟件測(cè)定條帶灰度值[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 水提時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

圖1 水提時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響Fig. 1 Effect of extraction time on the yield of flavonoids from C. tinctoria buds

由圖1可知，在水提時(shí)間2～17 min的范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，昆侖胎菊總黃酮的提取量均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。但考慮到日常生活中昆侖胎菊用于茶飲的水提時(shí)間一般不會(huì)超過15 min，故選擇水提時(shí)間14 min較佳。

2.1.2 水提溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

圖2 水提溫度對(duì)總黃酮提取量的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids from C. tinctoria buds

由圖2可知，在水提溫度75～100 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，昆侖胎菊總黃酮的提取量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到95 ℃以上，總黃酮提取量的增加不明顯。因此選擇水提溫度95 ℃較為合適。

2.1.3 液料比對(duì)總黃酮提取量的影響

圖3 液料比對(duì)總黃酮提取量的影響Fig. 3 Effect of water-to-material ratio on the yield of flavonoids from C. tinctoria buds

由圖3可知，在液料比為50∶1～100∶1的范圍內(nèi)，隨著液料比的增加，昆侖胎菊總黃酮的提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為70∶1（mL/g）時(shí)，總黃酮提取量達(dá)到最高值。因此最合適的液料比為70∶1。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，以考察各因素間的交互作用以及優(yōu)化最佳提取工藝，結(jié)果見表4。對(duì)表4的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總黃酮提取量對(duì)水提時(shí)間（A）、水提溫度（B）和液料比（C）的二次回歸模型方程為：

總黃酮提取量=-2 191.079 28+28.798 36A+36.740 05B+9.382 85C-0.163 97AB-0.010 747AC-0.045 800BC-0.385 66A2-0.160 00B2-0.033 759C2

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

表5 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance (ANOVA) for the yield of flavonoids against various extraction conditions

對(duì)此模型進(jìn)行回歸方差分析，由表5可知，總黃酮提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)的整體模型呈現(xiàn)極顯著水平（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明模型選擇合適?；貧w模型的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)均顯著，交互項(xiàng)AB、BC顯著，AC不顯著。表明各因素對(duì)于昆侖胎菊提取過程中總黃酮提取量的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由F值可知，各因素對(duì)總黃酮提取量影響大小順序?yàn)樗釙r(shí)間（A）＞水提溫度（B）＞液料比（C）?；貧w方差分析結(jié)果表明，該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.973 7，模型校正決定系數(shù)R2Adj為0.939 9，表明此模型可以解釋93.99%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的6.01%，不能用此模型來解釋。模型的變異系數(shù)為1.11%，較小，表明試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好。此外，模型的信噪比較高（為16.513），表明此模型的擬合度和可信度較好，可用于預(yù)測(cè)和優(yōu)化CBF提取工藝的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[21-22]。

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖4 各因素交互作用對(duì)總黃酮提取量的影響Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of three extraction parameters on the yield of flavonoids from C. tinctoria buds

為了更直觀反映各因素對(duì)昆侖胎菊總黃酮提取量的影響以及最佳工藝參數(shù)和參數(shù)間的交互作用，采用響應(yīng)面及其等高線圖分析，如圖4所示。圖4可以直觀地反映出水提時(shí)間、水提溫度和液料比3 個(gè)因素之間的交互作用對(duì)昆侖胎菊水溶性總黃酮提取量的影響。響應(yīng)面陡峭表明該因素對(duì)總黃酮提取量的影響較強(qiáng)，曲面平緩表明影響較弱；等高線的形狀可反映出各因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，趨于橢圓形表明兩因素的交互作用顯著，而圓形表明不顯著[23-24]。由圖4可知，比較響應(yīng)面的陡峭程度為水提時(shí)間（A）＞水提溫度（B）＞液料比（C），表明各因素對(duì)總黃酮提取量影響大小順序?yàn)樗釙r(shí)間（A）＞水提溫度（B）＞液料比（C），其結(jié)論同表5方差分析結(jié)論一致；比較3 個(gè)因素交互作用的等高線：AB橢圓形，AC圓形，BC橢圓形，表明水提時(shí)間與水提溫度、水提溫度與液料比交互作用顯著，水提時(shí)間與液料比交互作用不顯著，其結(jié)論同表5方差分析結(jié)論一致。

2.2.3 提取工藝條件的優(yōu)化及驗(yàn)證

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得的結(jié)果和二次回歸方程，利用Design-Expert軟件優(yōu)化分析得到總黃酮的最佳提取條件為：水提時(shí)間15.39 min、水提溫度95.89 ℃、液料比71.04∶1（mL/g），在此條件下預(yù)測(cè)的總黃酮提取量為143.04 mg/g，結(jié)合實(shí)際操作，選取最佳條件的近似值，即水提時(shí)間15 min、水提溫度96 ℃、液料比71∶1（mL/g）進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到總黃酮提取量為（145.45±4.60）mg/g，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差僅為1.68%，表明該回歸模型優(yōu)化得到的提取工藝條件實(shí)際有效。

2.2.4 CBF的高效液相色譜分析

研究表明，昆侖胎菊的活性成分主要是黃酮類化合物[2-3]。由圖5所示，CBF包含綠原酸（0.94±0.09） mg/g、黃諾馬苷（13.64±0.13）mg/g、兒茶素（2.22±0.11）mg/g、花旗松素（2.11±0.10） mg/g和馬里苷（13.39±0.34）mg/g，表明CBF的主要活性成分由酚酸和黃酮類化合物組成，其中黃酮類化合物種類更多且含量更高。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品（A）與CBF（B）色譜圖Fig. 5 Chromatograms of reference substances of CBF (A) and flavonoid composition of CBF (B)

2.3 CBF對(duì)衰老小鼠體質(zhì)量及一般行為學(xué)的影響

圖6 CBF對(duì)衰老小鼠體質(zhì)量變化的影響Fig. 6 Effect of CBF on body mass changes of aging mice

D-半乳糖長(zhǎng)期注射導(dǎo)致衰老小鼠動(dòng)物模型是抗衰老理論及藥理學(xué)研究的經(jīng)典方法[25-26]。D-半乳糖造衰老小鼠模型期間，觀測(cè)小鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)變化情況可反映其生長(zhǎng)發(fā)育及健康狀況[27]。由圖6所示，隨著衰老造模期間的延長(zhǎng)，各組小鼠體質(zhì)量均有所增加。衰老模型組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)逐漸緩慢，并出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)緩慢、皮膚松弛、毛色灰暗粗糙、經(jīng)常脫毛炸毛、經(jīng)常扎堆嗜睡、活動(dòng)量明顯減少等一般行為學(xué)狀況。從第7天開始，衰老模型組小鼠體質(zhì)量低于正常組，呈顯著性差異（P＜0.05），并且差異隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸增大的趨勢(shì)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，陽(yáng)性對(duì)照組（VE）和高劑量組（CBF-H）小鼠體質(zhì)量與正常組之間無顯著差異（P＞0.05），同時(shí)衰老小鼠在精神狀況、行動(dòng)、皮膚及毛發(fā)等狀態(tài)方面均得到一定改善。這說明CBF對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育無不良影響且可改善衰老小鼠的行為狀況，具有抗衰老作用[28]。

2.4 CBF對(duì)衰老小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)變化的影響

圖7 CBF對(duì)衰老小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響（HE染色，×200）Fig. 7 Effect of CBF on liver tissues of aging mice observed by HE staining (× 200)

大量研究表明，許多天然成分的用藥處理能在D-半乳糖誘導(dǎo)的動(dòng)物衰老模型中發(fā)揮有效的保肝作用[29-30]。如圖7所示，正常組小鼠肝組織顯示出正常的結(jié)構(gòu)和明顯的肝細(xì)胞邊界，沒有充血現(xiàn)象。與正常組小鼠相比，衰老模型組小鼠肝組織切片顯示出明顯的損傷，表現(xiàn)出幾種類型的病理?yè)p傷，如細(xì)胞間隙增大（長(zhǎng)箭頭）和氣球樣變性（短箭頭）。此外，肝細(xì)胞還觀察到其他損傷，如局灶性壞死，纖維化，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等。CBF的灌胃給藥有效地改善了D-半乳糖引起的肝臟異常變化。在VE組和低劑CBF-L組中，可觀察到肝臟細(xì)微充血，氣球樣變性和纖維化的改善；CBF-H組的改善效果更顯著，小鼠肝臟的組織病理學(xué)形態(tài)與正常組沒有明顯差異。結(jié)果表明，CBF對(duì)D-半乳糖引起的衰老小鼠肝損傷有一定抑制作用。

2.5 CBF對(duì)衰老小鼠肝臟SIRT1、p53蛋白表達(dá)的影響

大量研究表明，SIRT1與p53基因參與衰老過程的調(diào)節(jié)[15-16]。如圖8A所示，衰老模型組小鼠肝組織中SIRT1蛋白表達(dá)量顯著低于正常組（P＜0.05），降低了57.75%。與衰老組相比，VE及CBF高低劑量給藥處理均能顯著地提高衰老小鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)（P＜0.05），VE、CBF-L和CBF-H組分別提高了106.99%、160.45%和279.02%。如圖8B所示，衰老模型組小鼠肝組織中p53蛋白表達(dá)量顯著高于正常組（P＜0.05），提高了390.13%。與衰老組相比，除CBF-L組降低效果不顯著外，VE及CBF-H能顯著降低衰老小鼠肝組織p53蛋白表達(dá)（P＜0.05），VE、CBF-L和CBF-H組分別降低了23.22%、12.25%和30.90%。結(jié)果表明，CBF抑制衰老作用可能與激活SIRT1/p53信號(hào)通路有關(guān)。

圖8 CBF對(duì)衰老小鼠肝組織中SIRT1、p53蛋白表達(dá)的影響Fig. 8 Effect of CBF on protein expression levels of SIRT1 and p53 in liver tissues of aging mice

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以昆侖胎菊為原料，采用水溶劑提取法對(duì)其水溶性總黃酮進(jìn)行提取并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，即水提時(shí)間15 min、水提溫度96 ℃、液料比71∶1（mL/g），在此最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證得到提取液中的總黃酮提取量可達(dá)到145.45 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為1.68%，表明該回歸模型合理可靠，優(yōu)化得到的提取工藝條件實(shí)際有效。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)研究CBF對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用及其對(duì)衰老小鼠肝組織中SIRT1、p53蛋白表達(dá)的影響。造模過程觀測(cè)各組小鼠體質(zhì)量變化和一般行為學(xué)狀態(tài)表明，CBF對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育無不良影響且可改善衰老小鼠的行為狀況；各組小鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)觀測(cè)表明，VE和CBF能顯著改善D-半乳糖引起的肝組織異常變化，特別是CBF-H組小鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，幾乎沒有充血現(xiàn)象，與正常組小鼠肝組織細(xì)胞基本一致；Western blot法分析各組小鼠肝組織SIRT1、p53蛋白表達(dá)情況表明，CBF能顯著提升衰老小鼠肝組織中SIRT1蛋白表達(dá)（P＜0.05），有效抑制D-半乳糖引起的p53過量表達(dá)（P＜0.05）。以上結(jié)果說明CBF具有良好的抗衰老作用，其作用機(jī)理可能與激活SIRT/p53信號(hào)通路有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)以響應(yīng)面法優(yōu)化確定CBF的提取工藝，并初步探討其抗衰老作用機(jī)制，為昆侖胎菊實(shí)際應(yīng)用及食藥作用的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。