楊嘉丹，劉婷婷，張閃閃，曹宸瑀，王大為*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

銀耳（Tremella fuciformis）又名白木耳，雪耳[1]，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，營養(yǎng)豐富的藥食兩用菌，具有滋補(bǔ)生津、潤肺養(yǎng)胃之功效[2]。銀耳多糖來源于銀耳子實(shí)體、孢子、發(fā)酵液中分離純化得到的帶有分支的雜多糖，具有抗腫瘤、抗氧化[3]、降低血脂[4]、促進(jìn)傷口愈合[5]、增強(qiáng)免疫力[6]等功效。由于多糖普遍具有相對(duì)較大的分子質(zhì)量，通常以主鏈伴以側(cè)鏈的形式存在，同時(shí)它具有多個(gè)羥基和空間折疊結(jié)構(gòu)，故其具有其他物質(zhì)所不具有的加工特性和流變性質(zhì)[7]。許多天然存在的多糖由于其在不同條件下的獨(dú)特流變性質(zhì)而被用作增稠劑[8]、膠凝劑[9]和乳化劑[10]。雖然銀耳多糖的分子構(gòu)型、構(gòu)象和生物活性[1]已經(jīng)得到了廣泛研究，但是在水溶液中的動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性方面的研究依然非常有限，其凝膠特性目前鮮見相關(guān)報(bào)道。張姍姍等[11]將銀耳多糖浸提液作為部分乳化劑和增稠劑的替代，添加到花生蛋白飲料中提高了飲料穩(wěn)定性和質(zhì)構(gòu)特性。祁營利[12]探究了銀耳全粉的流變學(xué)特性和其作為一種增稠劑的效果。Zhang Yakun等[13]利用熱水浸提法提取了銀耳多糖，并研究了銀耳多糖的流變學(xué)特性及其與肌原纖維蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)銀耳多糖在低脂肪肉制品加工中具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的銀耳多糖提取方法多為熱水浸提法，該法耗時(shí)長、成本高、提取率低[14]。

近年來，微波技術(shù)用于天然植物有效成分的提取已有大量報(bào)道，它具有快速、高效、安全、提取率高、節(jié)能等特點(diǎn)[15]。本研究中采用微波輔助法提取的銀耳多糖，其黏度增加，表現(xiàn)出更好的流變特性和凝膠特性，有利于將銀耳多糖乃至銀耳全粉最大化地應(yīng)用于食品工業(yè)中替代部分膠體的使用，例如果凍、軟糖制品等。這為銀耳在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀耳采購于沃爾瑪超市，冷水清洗除雜后60 ℃烘干，粉碎后過篩得到不同粒度的銀耳粉備用。無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇（均為分析純） 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UWave-1000微波紫外超聲波三位一體合成萃取反應(yīng)儀上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；UV2100紫外-可見分光光度計(jì) 美國UNICO公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；Alpha1-4LDplus真空冷凍干燥機(jī)德國Marin Christ公司；IR Prestige傅里葉變換紅外光譜儀日本島津公司；DHR-3流變儀 美國TA公司；TA/XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；DF-II型集熱式磁力攪拌器 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波輔助提取銀耳多糖

準(zhǔn)確稱取所需粒度的銀耳粉10 g，按相應(yīng)的液料比加入蒸餾水，在一定時(shí)間和功率下進(jìn)行微波輔助提取。將提取液離心（4 000 r/min，20 min）收集上清液，上清液脫蛋白（1/5 Sevag試劑，正丁醇-氯仿（1∶4，V/V），振蕩20 min），濃縮，醇沉（4 倍體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，12 h，4 ℃），離心（4 000 r/min，20 min）得到的沉淀經(jīng)冷凍干燥后即為銀耳多糖。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

選取液料比、粒度、微波功率、微波時(shí)間為考察因素。提取溫度95 ℃，液料比設(shè)定為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g），粒度設(shè)定為60、80、100、120、140 目，微波功率設(shè)定為250、300、350、400、450 W，微波時(shí)間設(shè)定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，以銀耳多糖提取率為考察指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每組單因素試驗(yàn)做3 組平行。單因素試驗(yàn)中不變的因素設(shè)定為液料比60∶1（mL/g）、粒度100 目、微波功率300 W、微波時(shí)間1.0 h。

1.3.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)1.3.2節(jié)中的4 個(gè)單因素各取3水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定銀耳多糖的最佳提取工藝參數(shù)，因素與水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their levels used in orthogonal array design

1.3.4 銀耳多糖提取率計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程為y=0.010 5x+0.088 5，R2=0.996 5。

銀耳多糖提取率的測定：將銀耳多糖提取液稀釋到一定質(zhì)量濃度，吸取1 mL于具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟操作，于波長490 nm處測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出粗多糖的質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算多糖提取率：

式中：Y為多糖提取率/%；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出的銀耳多糖的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為樣品體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為銀耳粉質(zhì)量/g。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

參照李晉等[17]方法，稱取銀耳多糖2 mg，加入200 mg烘干至恒質(zhì)量的KBr，置研缽中研磨均勻，用電動(dòng)壓片機(jī)壓片，在4 000～400 cm-1范圍進(jìn)行紅外掃描。

1.3.6 流變特性測試

稱取銀耳多糖20、100、200、300、400 mg，分別溶于20 mL蒸餾水中，60 ℃水浴鍋內(nèi)攪拌至完全溶解，得到質(zhì)量濃度分別為1、5、10、15 mg/mL和20 mg/mL的銀耳多糖溶液。

使用具有40 mm平行板的流變儀研究銀耳多糖質(zhì)量濃度和溫度對(duì)其溶液黏度的影響，及不同溫度（5～40 ℃）和角頻率（0.1～100 r/s）下，不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液的動(dòng)態(tài)黏彈性行為。測量儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G’’）并將其繪制為角頻率的函數(shù)。

1.3.7 凝膠特性測試

稱取銀耳多糖1 000、1 250、1 500、1 750、2 000 mg，分別溶于50 mL蒸餾水中，60 ℃水浴鍋內(nèi)攪拌至完全溶解，然后立即轉(zhuǎn)移至冷水（4～10 ℃）中，得到質(zhì)量濃度為20、25、30、35 mg/mL和40 mg/mL的銀耳多糖凝膠。質(zhì)構(gòu)分析之前于4 ℃冰箱內(nèi)貯存過夜。

使用質(zhì)構(gòu)儀在室溫下進(jìn)行凝膠的質(zhì)構(gòu)分析。分析參數(shù)如下：P/36R不銹鋼圓柱形探頭，測前試速率和測中速率為1.0 mm/s，測后速率為10.0 mm/s，壓縮程度25%，觸發(fā)力5.0 g。每組實(shí)驗(yàn)平行3 次進(jìn)行。

1.3.8 溶解性測試

稱取一定量的銀耳多糖放入燒杯中，加定量蒸餾水，在60 ℃用磁力攪拌器攪拌，記錄多糖完全溶解所需時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行繪圖，SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 液料比（a）、粒度（b）、微波功率（c）及微波時(shí)間（d）對(duì)銀耳多糖提取率的影響Fig. 1 Effects of liquid/material ratio (a), raw material particle size (b),microwave power (c) and radiation time (d) on the extraction efficiency of polysaccharide from T. fuciformis

由圖1a可知，液料比在30∶1～60∶1（mL/g）時(shí)，銀耳多糖的提取率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)液料比大于60∶1（mL/g）時(shí)，銀耳多糖提取率呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)。適量的增加溶劑有利于提升銀耳多糖的提取率[18]，當(dāng)銀耳多糖充分溶出后，繼續(xù)增加溶劑使得后續(xù)濃縮和沉淀工藝難度加大，且提取率變化不顯著。因此，考慮到節(jié)約能源，選取液料比60∶1（mL/g）比較合適。

由圖1b可知，粒度對(duì)銀耳多糖提取率有一定影響，隨著粒度的變細(xì)，物料與溶劑接觸的表面積增大，有助于多糖加速溶出，使得銀耳多糖提取率增加。但當(dāng)物料粒度超過120 目時(shí)，粒度過細(xì)使得物料容易黏聚成團(tuán)，減小了與溶劑接觸的表面積，進(jìn)而銀耳多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)?？紤]成本和實(shí)際操作，選取粒度為120 目左右較為合適。

由圖1c可知，微波功率在250～450 W之間，隨著微波功率的增加，銀耳多糖的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)微波功率為400 W時(shí)，銀耳多糖的提取率最高，微波有助于提升物料內(nèi)部溫度使多糖加速溶出[19]，從而使得銀耳多糖提取率明顯增加。但微波功率過大會(huì)阻礙介質(zhì)滲入[20]，導(dǎo)致銀耳多糖提取率下降。因此，微波功率應(yīng)控制在400 W左右。

由圖1d可知，微波時(shí)間對(duì)銀耳多糖提取率的影響較為明顯，隨著微波時(shí)間的延長，銀耳多糖提取率增加，其原因可能是提取時(shí)間延長可明顯提高微波的反射、吸收和穿透效果，提高提取率[21]。當(dāng)微波時(shí)間超過2.0 h時(shí)，一次提取產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)外濃度差達(dá)到平衡，銀耳多糖提取率呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)?？紤]時(shí)間和成本因素，提取時(shí)間選擇2.0 h較好。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for orthogonal array design

根據(jù)表2中的R值可以得出，在所選試驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素對(duì)銀耳多糖提取率的影響主次為D（微波時(shí)間）＞B（粒度）＞C（微波功率）＞A（液料比）。由表3可知，液料比、粒度、微波功率和微波時(shí)間對(duì)提取率的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），這一結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。由正交試驗(yàn)結(jié)果得出，最優(yōu)方案為A1B2C2D2，即液料比50∶1（mL/g）、粒度120 目、微波功率400 W、微波時(shí)間2.0 h。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，此條件下銀耳多糖的提取率為（33.25±0.14）%。

2.3 銀耳多糖紅外光譜分析

圖2 銀耳多糖的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 FIIR spectrum of polysaccharides from T. fuciformis

如圖2所示，3 202 cm-1和2 926cm-1的吸收帶分別來自糖類分子的O—H和C—H伸縮振動(dòng)[22]。1 643 cm-1和1 416 cm-1可分別對(duì)應(yīng)于糖醛酸中的羰基C＝O振動(dòng)和羰基C—O伸縮振動(dòng)，這表明銀耳多糖是酸性多糖[23]。在1 026 cm-1和1 250 cm-1處的峰分別是由于糖環(huán)中的C—O—C伸縮振動(dòng)和C—H可變角振動(dòng)[24]。806 cm－1處的吸收峰為α-型吡喃糖的C—H彎曲振動(dòng)或硫酸鹽組中的C—O—S[23,25]。這些結(jié)果表明銀耳多糖是含有硫酸化基團(tuán)和糖醛酸的酸性雜多糖。

主要由糖醛酸組成的藻酸鹽和主要由硫酸化基團(tuán)組成的角叉菜膠以其流變性和膠凝行為而被廣泛用于食品和生物醫(yī)藥行業(yè)[26-27]。類似的還有從滸苔中提取的多糖[28]。因此，具有硫酸化基團(tuán)和糖醛酸的獨(dú)特多糖鏈的銀耳多糖，可能具有相似的流變性質(zhì)和膠凝行為。

2.4 銀耳多糖流變特性

2.4.1 剪切速率對(duì)黏度和應(yīng)力的影響

圖3 銀耳多糖溶液的穩(wěn)定剪切黏度η（a）和應(yīng)力σ（b）對(duì)剪切速率的依賴性Fig. 3 Shear rate dependence of steady shear viscosity (a) and stress (b) of TPS solutions at 25 ℃

表4 冪律模型擬合參數(shù)Table 4 Fitting parameters for the power law model

在25 ℃測試剪切黏度（η）對(duì)剪切速率在0.1～1 000 s－1之間的依賴性（圖3a）。所有質(zhì)量濃度下，銀耳多糖溶液的剪切黏度隨著剪切速率的增加而降低，表明銀耳多糖溶液表現(xiàn)出剪切變稀的假塑性[29]。但不同質(zhì)量濃度的黏度變化率不同。對(duì)于高質(zhì)量濃度的溶液，黏度隨著質(zhì)量濃度的增加而下降得更快；在相同的剪切速率下，溶液黏度隨著質(zhì)量濃度的增加而增加。

隨著剪切速率的增加，應(yīng)力變化曲線（圖3b）顯示出與黏度曲線相反的趨勢(shì)。在所有質(zhì)量濃度下，銀耳多糖溶液的應(yīng)力隨著剪切速率的增加而增加，同樣也表明了溶液的剪切稀化行為。

將曲線擬合為冪律方程：η=kγn-1，其中，η為剪切黏度，k為一致性指數(shù)，γ為剪切速率，n為流動(dòng)行為指數(shù)。n也稱為假塑性指數(shù)，即n為0～1的流體被歸類為假塑性流體；如果n=1，則流體為牛頓流體。如表4所示，通過冪律方程可以解釋銀耳多糖溶液的剪切稀化行為?？梢钥吹剑到y(tǒng)的n值在0.424 5～0.859 9之間，并且較高質(zhì)量濃度溶液顯示出更大的剪切稀化能力，表明了銀耳多糖溶液是假塑性流體。隨著銀耳多糖質(zhì)量濃度的增加，各個(gè)分子開始重疊，形成分子間連接或“連接區(qū)”，這種行為限制了含水體系中聚合物鏈的運(yùn)動(dòng)和拉伸。因此，黏度隨著質(zhì)量濃度的增加而顯著增加[30]。

圖4 不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液Fig. 4 Photos of TPS solutions at different concentrations

如圖4所示，將6 種不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液置于試管中，在4 ℃以45°傾斜24 h后觀察樣品狀態(tài)。隨著質(zhì)量濃度的增加，溶液透明度降低并且銀耳多糖溶液的黏度增加（圖3、4）。圖4顯示，與其他樣品相比，20 mg/mL溶液的流動(dòng)性顯著減弱并且傾斜表面不再是水平的，初步形成了弱凝膠結(jié)構(gòu)。在下面的凝膠特性研究中，將著重于20 mg/mL及其以上質(zhì)量濃度的銀耳多糖凝膠。

2.4.2 溫度對(duì)表觀黏度的影響

如圖5所示，在1 000 s-1的剪切速率下，所有質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液的黏度隨著溫度的升高而降低。這可能是因?yàn)樘岣邷囟却龠M(jìn)了分子運(yùn)動(dòng)，使得銀耳多糖分子的卷曲結(jié)構(gòu)得到伸展，分子間的相互作用增強(qiáng)，且液體體積以及每個(gè)分子的平均占有體積增大，因此，整個(gè)體系的表觀黏度降低[31]。

圖5 剪切速率為1 000 s－ 1時(shí)銀耳多糖溶液表觀黏度對(duì)溫度的依賴性Fig. 5 Temperature dependence of apparent viscosity (η) of TPS solutions at shear rate of 1 000 s-1

2.4.3 動(dòng)態(tài)黏彈性

圖6 不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液在25 ℃的動(dòng)態(tài)流變學(xué)（A）以及10 mg/mL銀耳多糖溶液在不同溫度下的動(dòng)態(tài)流變學(xué)（B）Fig. 6 Dynamic rheology of TPS solutions of different concentrations at 25 ℃ (A) and dynamic rheology of 10 mg/mL TPS solution at various temperatures (B)

圖7 25 ℃不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液的tanδ和角頻率的關(guān)系（A）和不同溫度下10 mg/mL的銀耳多糖溶液的tanδ和角頻率的關(guān)系（B）Fig. 7 Relationship between tanδ of TPS solutions of different concentrations and angular frequency at 25 ℃ (A) and between tanδ of 10 mg/mL TPS solution and angular frequency at various temperatures (B)

如圖6和圖7所示，在25 ℃，G’和G″值隨角頻率的增加而增加（圖6A）。在低頻區(qū)域，所有質(zhì)量濃度下的G″都高于G’，表明銀耳多糖溶液在低角頻率下不能形成凝膠。G’和G’’的曲線在高頻區(qū)域相交后，G’高于G’’，表明銀耳多糖溶液此時(shí)可以形成弱凝膠結(jié)構(gòu)。tanδ（G’’/G’）值也可用于解釋溶液的流變行為。tanδ＜0.1，表示傳統(tǒng)的彈性凝膠，而tanδ＞0.1，傳統(tǒng)的弱凝膠[32]。由圖7A可以看到，銀耳多糖溶液不形成強(qiáng)彈性凝膠結(jié)構(gòu)。在所有溫度下，G’和G’’都隨著角頻率的增加而增加（圖6B）。在降低溫度時(shí)，G’顯著增加，G’和G’’的頻率依賴性降低。可以得出，銀耳多糖溶液僅在低溫和高角頻率下才能形成弱凝膠結(jié)構(gòu)。圖7B顯示10 mg/mL銀耳多糖溶液的tanδ隨著角頻率的增加而顯著降低，并且該降低的速率隨著溫度的升高而增加。因此，銀耳多糖溶液在低角頻率和高溫下不能形成凝膠結(jié)構(gòu)。銀耳多糖具有線性化學(xué)結(jié)構(gòu)，其在水溶液中變?yōu)槔p繞結(jié)構(gòu)，并且纏繞程度隨著剪切速率的增加而增加[24]。其他真菌多糖也有類似的現(xiàn)象，如黃山花菇多糖[33]。

2.5 質(zhì)構(gòu)特性測定結(jié)果

如圖8所示，將5 種不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖凝膠置于試管中，在4 ℃以45°傾斜24 h后觀察樣品狀態(tài)。在低質(zhì)量濃度下，凝膠具有良好的透明度，傾斜表面和強(qiáng)流動(dòng)性。隨著質(zhì)量濃度的增加，凝膠透明度和表面傾斜度降低，流動(dòng)性減弱，并且表現(xiàn)出良好的凝膠化性能。

圖8 不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖凝膠Fig. 8 Photos of TPS gels at different concentrations

表5 不同質(zhì)量濃度銀耳多糖凝膠的質(zhì)構(gòu)特性Table 5 Textural characteristics of TPS gels at different concentrations

如表5所示，隨著銀耳多糖質(zhì)量濃度的增加，凝膠的硬度和咀嚼性增加，彈性降低。然而，當(dāng)銀耳多糖質(zhì)量濃度分別為35 mg/mL和40 mg/mL時(shí)，彈性增加至13.05%和17.23%。這些結(jié)果表明銀耳多糖與系統(tǒng)中的水之間存在一定的協(xié)同作用。增加的銀耳多糖在凝膠中產(chǎn)生填充效果，增強(qiáng)了這種協(xié)同作用。根據(jù)硬度和彈性值，銀耳多糖可以開發(fā)成一些產(chǎn)品，如果凍和軟糖。這意味著銀耳多糖可以用作食品中部分膠體的替代品。

2.6 溶解性結(jié)果

圖9 60 ℃銀耳多糖的溶解性Fig. 9 Solubility of TPS at 60 ℃

由圖9可知，在60 ℃，銀耳多糖的溶解性隨質(zhì)量濃度的增大而減小。在多糖溶液中，水與多糖的羥基形成大量的氫鍵，水化的多糖大分子形成環(huán)狀、螺旋狀或雙螺旋結(jié)構(gòu)，再通過分子的伸展及不同的點(diǎn)鍵合而構(gòu)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并在一定質(zhì)量濃度下形成凝膠[34]。通過對(duì)銀耳多糖溶解性的研究，可為其在食品中產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用及開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié) 論

采用微波輔助法提取銀耳多糖，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到實(shí)際最佳工藝條件為液料比50∶1（mL/g）、粒度120 目、微波功率400 W、微波時(shí)間2.0 h，此時(shí)多糖提取率達(dá)到（33.25±0.14）%。

通過傅里葉變換紅外光譜和流變學(xué)研究表明，銀耳多糖溶液是具有剪切稀化行為的假塑性流體。銀耳多糖溶液的動(dòng)態(tài)黏彈性行為表明，G’和G″都表現(xiàn)出對(duì)質(zhì)量濃度，溫度和tanδ的強(qiáng)烈依賴性，在低溫和高頻下可以形成弱凝膠結(jié)構(gòu)。通過質(zhì)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)銀耳多糖質(zhì)量濃度顯著影響其凝膠的硬度、彈性和咀嚼性。此外，銀耳多糖質(zhì)量濃度對(duì)其溶解性的影響較大，其溶解性隨質(zhì)量濃度的增加而降低。結(jié)果表明，銀耳多糖具有良好的流變和凝膠特性，在食品加工中可提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值并減少食用膠的使用量，拓寬銀耳多糖的應(yīng)用范圍，提升其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，以期為我國新型食品的開發(fā)提供理論指導(dǎo)。