王靈玲，潘 鑫，方 勇*，施曉天，李 彭，馬 寧，裴 斐，楊文建，胡秋輝

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210023）

秈米碎米和金針菇菌根是農(nóng)產(chǎn)品加工過程中出現(xiàn)的原料副產(chǎn)物[1]。秈米蛋白具有低過敏性和高生物價的特點，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，與動物蛋白相比，成本低，開發(fā)利用空間大，但因其賴氨酸缺乏，限制了以秈米蛋白為主的功能性產(chǎn)品的開發(fā)與利用[2]。賴氨酸能增強記憶，提高智力。金針菇是一種食用菌，其賴氨酸含量豐富，谷氨酸和天冬氨酸等呈味氨基酸含量高，有“益智菇”之稱[3]。根據(jù)氨基酸互補原理，將秈米蛋白和金針菇蛋白進行復配是一種有效手段。但是2 種原料蛋白簡單混合可能會導致組分分布不勻，營養(yǎng)不均的現(xiàn)象。

蛋白提取方法主要有物理法、化學法和酶法提取[4-5]。朱廣成等[6]采用物理法提取金針菇蛋白，提取過程無污染，但得率低。王美玉等[7]采用堿法制備燕麥蛋白，提取率高。Shen Lianqing等[8]用酶法提取茶蛋白，雖然反應條件溫和，但提取率較低。史瑞婕等[9]采用酶法和堿法結(jié)合法提取杏鮑菇蛋白，其提取率與純度優(yōu)于堿法提取。目前，關于蛋白質(zhì)提取方法的研究熱點主要是借助物理手段研究蛋白的提取工藝，Zhang Longtao等[10]采用超聲輔助堿法提取大米蛋白，一定程度上提高了溶解性。Yang Xue等[11]用超聲和酶法結(jié)合提取大米蛋白，提高了蛋白的提取率與純度。但是同步提取2 種蛋白的方法鮮見報道。本研究旨在提供同步提取秈米碎米和金針菇菌根混溶蛋白的工藝條件，提高混溶蛋白均勻性，縮短提取時間，避免重復勞動，簡化蛋白復配流程。用氨基酸分析儀測定游離氨基酸含量，根據(jù)世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧農(nóng)組織（World Health Organization/Food and Agriculture Organization，WHO/FAO）提出的必需氨基酸參考模式，和氨基酸平衡原理對混溶蛋白進行營養(yǎng)特性分析，為其高附加值利用提供理論依據(jù)。

本研究采用超聲波輔助同步提取秈米碎米和金針菇菌根混溶蛋白，通過單因素試驗篩選影響提取率的因素水平，以提取率和純度為綜合考慮指標，設計正交試驗優(yōu)化工藝條件，利用氨基酸分析、色澤和體外消化等指標對比同步提取的蛋白與單獨蛋白的產(chǎn)品外觀和營養(yǎng)價值，以期獲得營養(yǎng)價值全面的混溶蛋白產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈米碎米 南京遠望富硒農(nóng)產(chǎn)品有限責任公司；金針菇菌根 南京仙林農(nóng)貿(mào)市場；胃蛋白酶、胰蛋白酶南京奧體福尼生物科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、硫酸銅、硼酸、硫酸鉀（均為分析純） 南京化學試劑有限公司；所有實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

L-8900型全自動氨基酸分析儀 日立高新技術公司；K-37自動凱氏定氮儀 瑞士步琦有限公司；PS-20超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；CM-5色差儀柯尼卡美能達有限公司；FD-STD冷凍干燥機 北京照生行儀器設備有限公司；FE28 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所有限公司；FW100高速萬能粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；TE124S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；JJ-2組織搗碎機 江蘇省金壇市中大儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 秈米蛋白和金針菇蛋白單獨提取工藝

秈米蛋白提取參照萬娟等[12]的方法，略作修改，取一定量秈米，磨粉（過80 目篩）與0.09 mol/L NaOH溶液按料液比1∶6（g/mL），置于-20 ℃冰箱4 h，常溫融化，在25 ℃恒溫水浴提取4 h，離心（8 000 r/min）取上清液，調(diào)節(jié)pH值至5.5，水洗數(shù)次，凍干成粉。

金針菇蛋白提取參考張樂[13]和朱廣成等[6]的方法，略作修改。取一定量金針菇菌根，烘干磨粉（過80 目篩）與0.14 mol/L NaCl按料液比1∶15（g/mL）混合，置于-20 ℃冰箱4 h，常溫融化，在30 ℃，120 W條件下超聲20 min，離心（8 000 r/min）取上清液，調(diào)節(jié)pH值至4，水洗數(shù)次，凍干成粉。

1.3.2 混溶蛋白提取工藝流程

原料（秈米與金針菇菌根）→研磨過篩（80 目）→按比例備料→凍融（-20 ℃，4 h）→超聲堿提（0.09 mol/L NaOH）→離心（8 000 r/min，20 min）→上清液調(diào)節(jié)pH值至5.5→離心（8 000 r/min，20 min），取沉淀→水洗數(shù)次→冷凍干燥。

1.3.3 同步提取混溶蛋白的單因素試驗設計

以混溶蛋白的提取率為指標，分別對原料比，堿提料液比、超聲時間、超聲溫度和超聲功率5 個因素進行單因素試驗。設定原料比為10∶1、9∶2、8∶3、7∶4、6∶5（g/g），堿提料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），超聲時間為10、15、20、25、30 min，超聲溫度為20、30、40、50、60 ℃，超聲功率為200、300、400、500 W。

1.3.4 同步提取混溶蛋白工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果設計正交試驗，以同步提取混溶蛋白的提取率與純度為參考指標，設計L9（34）正交試驗表，進行提取工藝參數(shù)的優(yōu)化。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測定

采用凱氏定氮法，參照GB 5009.5—2016《食品中氨基酸的測定》[14]方法進行測定。由公式（1）、（2）計算提取率與純度：

式中：X為混溶蛋白的提取率/%；A為混溶蛋白的質(zhì)量/g；B為秈米和金針菇菌根總質(zhì)量/g；W為蛋白質(zhì)的純度/%；L為凍干粉混溶蛋白的質(zhì)量/g；N為凍干粉的總質(zhì)量/g。

1.3.6 蛋白質(zhì)色差測定

參照Yu Zhilong等[15]方法，采用CM-5色差儀測量各蛋白樣品的外觀色澤，通過標準白板校準（L1*，99.54；a1*，-0.07；b1*，-0.29），將每個樣品放在標準板上記錄L*、a*、b*值?？偵钍歉鶕?jù)公式（3）計算：

式中：L1*、a1*和b1*為從白板獲得的顏色參數(shù)；L2*、a2*和b2*為從樣品測量的顏色參數(shù)。

1.3.7 蛋白質(zhì)體外消化率

采用胃蛋白酶-蛋白酶體外消化模型[16-17]。取一定質(zhì)量的樣品溶于0.1 mol/L HCl溶液中，于37 ℃水浴中預熱5 min，酶與底物質(zhì)量比1∶100加入胃蛋白酶，在37 ℃恒溫振蕩器上反應2 h，再用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0終止消化反應。最后以酶與底物質(zhì)量比為1∶250（g/g）加入胰蛋白酶，消化2 h后煮終止反應，取樣分析。

體外消化率采用三氯乙酸氮溶指數(shù)法[18-19]測定和計算。取5 mL不同消化液于5 mL 10%三氯乙酸中，4 000 r/min離心20 min，沉淀用10%三氯乙酸洗滌2 次，離心得到三氯乙酸不溶組分。三氯乙酸不溶性氮含量采用凱氏定氮法測得（GB 5009.5—2016）。體外消化率按公式（4）計算：

式中：Y為體外消化率/%；Q為蛋白樣品中三氯乙酸不溶性氮的質(zhì)量/g；P為蛋白樣品中消化后三氯乙酸不溶性氮的質(zhì)量/g；M為蛋白樣品的質(zhì)量/g。

1.3.8 氨基酸組成測定及營養(yǎng)價值評價

1.3.8.1 氨基酸分析

參照Liu Ying等[20]的方法略作修改。稱取0.200 0 g樣品，用30 mL濃度為6 mol/L的HCl溶液于110 ℃水解樣品24 h，濾紙過濾后用6 mol/L HCl溶液定容至50 mL，取3 mL旋蒸至干，加入30 mL濃度為0.02 mol/L HCl溶液，過0.22 μm濾膜進樣瓶，采用氨基酸分析儀測定氨基酸含量。游離氨基酸含量按公式（5）計算：

式中：H為游離氨基酸含量/（mg/g）；E為游離氨基酸物質(zhì)的量/mol；F為該氨基酸的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；G為稀釋倍數(shù)；K為樣品總質(zhì)量/g。

1.3.8.2 蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價

根據(jù)氨基酸平衡理論[21]，計算氨基酸比值、氨基酸比值系數(shù)和比值系數(shù)分，計算公式如下：

比值系數(shù)分=100-CV×10 （8）

式中：C為待評蛋白質(zhì)某必需氨基酸含量/（mg/g）；D為WHO/FAO模式中相應必需氨基酸含量/（mg/g）；CV為氨基酸比值系數(shù)的變異系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018軟件作圖，采用JMP10（Student-t測驗）分析軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 同步提取秈米和金針菇混溶蛋白單因素試驗結(jié)果

2.1.1 原料比和料液比對混溶蛋白提取率的影響

圖1 原料比（A）和料液比（B）對秈米和金針菇混溶蛋白提取率的影響Fig. 1 Effect of raw material ratio (A) and material to liquid ratio (B)on the extraction efficiency of protein

由圖1A可知，秈米和金針菇混溶蛋白的提取率隨著原料比的增大呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。當原料比為8∶3（g/g）時，該混溶蛋白的提取率達到最大值47%。

由圖1B可知，堿提料液比從1∶5（g/mL）增大至到1∶15（g/mL），相應的提取率從40%提高到68%。而當堿提料液比從1∶15（g/mL）升高到1∶25（g/mL），提取率先降低后趨于平緩。這可能因為隨著堿提料液比變大，其溶劑體積增加，使溶劑與溶質(zhì)接觸更加充分，促進混溶蛋白部分溶解，當接觸程度最大化后，再增加堿提料液比，對提取率便無顯著影響[22]。

2.1.2 超聲溫度和超聲時間對混溶蛋白提取率的影響

圖2 超聲溫度（A）和超聲時間（B）對秈米和金針菇混溶蛋白提取率的影響Fig. 2 Effect of ultrasonication time (A) and temperature (B) on the extraction efficiency of protein

如圖2A所示，超聲溫度從20 ℃升高至60 ℃，秈米碎米和金針菇菌根混溶蛋白提取率增大。這是因為隨著溫度的不斷上升，水分子熱運動加劇，兩者接觸概率提高，蛋白溶解度增大。此外，溫度的上升也會使蛋白質(zhì)分子空間得以拉伸，促進可溶性蛋白質(zhì)和小分子氨基酸的形成[23]。但是，超聲溫度從50 ℃升高至60 ℃，雖然分子運動加快，但其提取率無顯著變化，這可能是因為較高溫引起蛋白質(zhì)的變性或者固化的作用[24]。

如圖2B所示，當超聲時間從10 min增加至20 min，混溶蛋白提取率增大。這可能是因為伴隨超聲時間的延長，蛋白質(zhì)一些親水基團充分暴露，與水分子反應，增加蛋白提取率[25-26]。超聲時間從20 min到30 min提取率下降，可能是因為已經(jīng)從原料中溶解出來的少許蛋白質(zhì)與淀粉重新進行締合[26]。

2.1.3 超聲功率對混溶蛋白提取率的影響

圖3 超聲功率對秈米和金針菇混溶蛋白提取率的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of protein

由圖3可知，秈米和金針菇混溶蛋白提取率隨超聲功率的提高而不斷提高。這是因為隨著超聲功率的不斷提高，空化作用增強，釋放出更多的蛋白，使混溶蛋白的提取率增加[27]。超聲功率升高為500 W時，混溶蛋白提取率高達69%。最終確定秈米和金針菇混溶蛋白提取的最佳提取功率為500 W。

2.2 同步提取混溶蛋白工藝的正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，設計L9（34）正交試驗，并以混溶蛋白提取率和純度作為綜合評價指標，篩選出同步提取的最佳工藝參數(shù)，試驗設計及結(jié)果見表1。

表1 同步提取秈米及金針菇混溶蛋白正交試驗設計及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results

提取率的高低體現(xiàn)了同步提取秈米碎米和金針菇菌根蛋白的可能性大小，純度的高低表明了同步提取混溶蛋白的市場應用前景的大小，兩者綜合考慮分析，以提取率為主要考慮指標，蛋白質(zhì)純度為次要指標篩選最佳工藝參數(shù)。由表1可知，原料比對提取率和純度都有較大影響，超聲時間對提取率和純度影響較小。當原料比為9∶2（g/g）和8∶3（g/g）時，提取率與純度高，但原料比對提取率是第1影響因素，對純度是第2影響因素，因此選擇A1。當堿提料液比為1∶15（g/mL）和1∶20（g/mL）時，提取率與純度都較高，但料液比對于純度是最次要因素，即料液比對提取率影響大，而對純度影響小，因此選擇B3。超聲溫度為50 ℃時，提取率與純度都高，因此選擇C2。超聲時間為25 min，提取率與純度都高，因此選擇D3。綜上，優(yōu)化正交試驗結(jié)果，得出最佳工藝參數(shù)條件（A1B3C2D3）：原料比9∶2（g/g）、料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度50 ℃、超聲時間25 min。經(jīng)驗證實驗，秈米和金針菇混溶蛋白的提取率為（69.30±1.30）%，純度為（80.07±0.63）%，即同步提取秈米和金針菇混溶蛋白的工藝條件是可行的。

2.3 秈米和金針菇混溶蛋白的營養(yǎng)特性評價

2.3.1 秈米和金針菇混溶蛋白的游離氨基酸含量

表2 同步提取蛋白與單獨提取混溶蛋白游離氨基酸含量比較Table 2 Comparison of free amino acid contents in separately and simultaneously extracted proteins

由表2可知，秈米蛋白必需氨基酸含量豐富，但是其賴氨酸含量較低（考慮了甲硫氨酸和半胱氨酸的轉(zhuǎn)化作用），這與楊倩等[28]研究結(jié)果相似。而金針菇蛋白中賴氨基酸含量豐富，同步提取后，混溶蛋白的賴氨酸含量提高。不僅如此，亮氨酸、苯丙氨酸等其他16 種氨基酸也進行了不同程度的互補，使秈米和金針菇混溶蛋白的氨基酸含量更加均衡，進一步強化了混溶蛋白的營養(yǎng)價值。超聲輔助同步提取的混溶蛋白的半胱氨酸并沒有得到互補，這可能與甲硫氨酸循環(huán)有關。甲硫氨酸在與三磷酸腺苷作用下為活性物質(zhì)提供甲基，生成的S腺苷甲硫氨酸在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，形成S腺苷同型半胱氨酸，脫去腺苷，生成同型半胱氨酸，進一步通過酶的催化作用，重新生成甲硫氨酸[29]。

2.3.2 秈米和金針菇混溶蛋白的營養(yǎng)價值評分

本實驗采用氨基酸比值系數(shù)法評價各蛋白的營養(yǎng)價值。如果食物蛋白質(zhì)氨基酸組成含量比例與參考模式一致，則各種氨基酸的氨基酸比值系數(shù)應等于1，氨基酸比值系數(shù)值最小的為第1限制氨基酸。由表3可知，秈米蛋白第1限制氨基酸是賴氨酸，經(jīng)同步提取的混溶蛋白的第1限制氨基酸為含硫氨酸（甲硫氨酸+半胱氨酸）。如果蛋白中氨基酸組成含量比例與參考模式中接近，則其氨基酸比值系數(shù)值應接近1，SRC接近100[21]。秈米蛋白比值系數(shù)分為63.20，而秈米和金針菇混溶蛋白比值系數(shù)分為79.70，其比值系數(shù)分提高，更易被人體吸收，進一步證明了同步提取秈米與金針菇混溶蛋白這種方法能顯著提高其營養(yǎng)價值。

2.3.3 秈米和金針菇混溶蛋白產(chǎn)品的色澤外觀與體外消化率

如表4所示，L*值大，樣品偏白，a*值小，說明偏綠，b*值大，表示偏紅。同步提取的混溶蛋白的總色差ΔE為（50.31±0.48），與單獨提取的2 種原料蛋白有顯著差異，這是因為同步提取后不同顏色的兩種原料蛋白融合，這也進一步說明了同步提取的可行性?；烊艿鞍椎捏w外消化率為（89.40±0.90）%，高于脫酰胺處理的大米蛋白[30]，這可能是因為超聲輔助提取改變了混溶蛋白的結(jié)構(gòu)，提高了溶解度[31]?；烊艿鞍椎南逝c金針菇蛋白無顯著差異，但卻低于秈米蛋白，這可能是因為金針菇中多糖和酚類物質(zhì)的存在使混溶蛋白雜質(zhì)含量增大，影響了混溶蛋白的體外消化率[32-33]，但其具體作用機理尚不清楚。這些問題是下一步研究需要明確的。

表3 同步提取秈米和金針菇混溶蛋白與單獨提取蛋白營養(yǎng)價值對比Table 3 Comparison of nutritional values of mixed and separate proteins

表4 同步提取秈米和金針菇混溶蛋白與單獨提取蛋白色澤外觀和體外消化率Table 4 Comparison of color and in vitro digestibility of mixed and separate proteins

3 結(jié) 論

超聲輔助同步提取秈米和金針菇菌根混溶蛋白的最優(yōu)工藝條件為原料比9∶2（g/g）、超聲溫度50 ℃、料液比1∶20（g/mL）、超聲時間25 min、超聲提取功率500 W，測得提取率為（69.30±1.30）%，純度（80.07±0.63）%，氨基酸比值系數(shù)分為79.70，色差值為50.31±0.48，體外消化率為（89.40±0.90）%，得到的產(chǎn)品營養(yǎng)價值高。因此，超聲輔助同步提取是一種可以改善秈米蛋白和金針菇蛋白營養(yǎng)組成的有效技術手段，比單獨提取兩種蛋白再將其進行復配的工藝簡單、能耗低，獲得的混溶蛋白營養(yǎng)價值較全面。