羅 超，吳偉斌，周 瑾，魏熵熵，厲美洋

（1.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院，浙江紹興312000；2.肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，廣東肇慶526020）

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶〔poly（ADP-ribose）polymerase，PARP〕，是一類與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)的核酶，迄今已發(fā)現(xiàn)的PARP 家族成員多達(dá)18 個亞型，其中PARP-1 在真核細(xì)胞內(nèi)含量最高，對其結(jié)構(gòu)和功能的研究也最為深入［1］。在生物體內(nèi)，PARP-1 主要參與DNA 損傷修復(fù)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄；與腫瘤、炎癥損傷等發(fā)病機制密切相關(guān)［2-4］。研究顯示，PARP-1在哮喘、慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）和急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）等肺部炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的調(diào)控作用，通過基因敲除、siRNA 干擾或藥物抑制等方法抑制PARP-1，有助于肺部炎癥性疾病的控制和恢復(fù)，也預(yù)示著PARP-1 及其信號通路有望成為哮喘和ALI 等肺部炎癥疾病治療的潛在新靶點［5-6］。

奧拉帕尼（olaparib）是目前上市的首個口服PARP-1 抑制劑，于2014 年由美國FDA 批準(zhǔn)上市，目前，臨床主要用于卵巢癌的治療［7］。其作用機制主要為奧拉帕尼通過抑制PARP-1 介導(dǎo)的DNA 單鏈或雙鏈損傷修復(fù)，導(dǎo)致帶有乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）突變的腫瘤細(xì)胞DNA 代謝紊亂，最終引起腫瘤細(xì)胞凋亡［8］。除抗腫瘤作用外，該藥通過抑制PARP-1介導(dǎo)的抗炎活性也越來越受到關(guān)注。目前，體內(nèi)研究已證明，其對哮喘和COPD等肺部炎癥性疾病具有良好的抗炎治療效果，可有效抑制炎癥因子的表達(dá)和炎癥細(xì)胞的遷徙浸潤，緩解肺部水腫及病理損傷［9-10］。然而，關(guān)于其進(jìn)一步抗炎機制的研究則相對較少，本研究以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎癥損傷為模型，研究新型PARP-1 抑制劑奧拉帕尼的抗炎作用機制，以期為肺部炎癥性疾病的治療研究提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

奧拉帕尼購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LPS 購于美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清和谷氨酰胺均購于美國Gibco 公司；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6），IL-8 和IL-10 ELISA 檢測試劑盒購于深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；Trizol Reagent，c DNA 合成試劑盒，SYBR Green qPCR Mix，活性氧檢測試劑盒購于上海碧云天生物；兔抗人PARP-1，P65，磷酸化P65（phosphoralated P65，p-P65），IκB 激酶β（IκB kinase β，IKKβ），p-IKKβ，抑制蛋白κB（inhibitor of kappa B，IκBα）和p-IκBα 多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體和ECL 發(fā)光液均購于美國Affinity Biosciences 公司。PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

生物倒置顯微鏡（日本Olympus），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，多功能酶標(biāo)儀，熒光定量PCR儀，超微量核酸蛋白測定儀（美國Thermo Scientific），電泳儀及轉(zhuǎn)移裝置（美國Bio-Rad），流式細(xì)胞儀（美國Beckman）。

1.2 細(xì)胞及分組

人肺腺癌上皮細(xì)胞A549購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺的RPMI-1640 培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，待細(xì)胞生長至70%～80%融合度后進(jìn)行傳代。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為溶劑對照組，設(shè)LPS 10mg·L-1作用24 h組，LPS+奧拉帕尼10 和25 μmol·L-1組（同時加入），作用24 h。

1.3 ELISA 檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6，IL-8 和IL-10含量

調(diào)整細(xì)胞密度為1×108L-1，加96 孔板內(nèi)，每孔100 μL，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，按1.2 分組加藥處理，作用24 h，收集細(xì)胞上清液，采用ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6，IL-8和IL-10的含量，按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀測定A450nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。

1.4 實時定量PCR 檢測細(xì)胞TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8和ICAM-1 m RNA表達(dá)

按每孔1×106細(xì)胞接種12 孔板，按1.2 分組加藥處理24 h 后，收集各組細(xì)胞，以Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參，在熒光定量PCR儀上用相應(yīng)的引物、c DNA等材料按步驟進(jìn)行擴增，采用2-ΔΔCt相對定量法進(jìn)行基因表達(dá)分析。TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8 和ICAM-1 對應(yīng)的PCR引物見表1。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS 水平

按每孔1×106細(xì)胞接種6孔板，按1.2分組加藥處理24 h 后，細(xì)胞收集后懸浮于終濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，孵育完畢后，用不含血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，流式細(xì)胞儀檢測。無熒光的DCFH 進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)ROS 氧化為有熒光的DCF，通過檢測DCF 熒光強度可間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

Tab.1 Sequence of real-time-PCR primers

1.6 Western印跡法檢測細(xì)胞PARP-1蛋白表達(dá)和P65，IKKβ和IκBα蛋白磷酸化水平

按每孔1×106細(xì)胞接種12 孔板，按1.2 分組加藥處理24 h后，收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清，以BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗人PARP-1，P65，p-P65，IKKβ，p-IKKβ，IκBα 和p-IκBα 多抗（1∶1000）4℃孵育過夜，洗膜后，室溫下加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶5000）孵育1 h，最后通過ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影成像，利用Image J 軟件進(jìn)行蛋白相對積分吸光度分析，以β肌動蛋白為內(nèi)參，以目標(biāo)蛋白與β 肌動蛋白積分吸光度值比值表示PARP-1，P65，p-P65，IKKβ，p-IKKβ，IκBα 和p-IκBα蛋白相對表達(dá)量。以蛋白磷酸化水平（p-P65/P65，p-IKKβ/IKKβ，p-IκBα/IκBα）表示NF-κB通路磷酸化激活水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s 表示，應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多樣本均數(shù)間比較采用one-way ANOVA 檢驗，組間的兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 奧拉帕尼對LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞IL-6，IL-8和IL-10釋放的影響

與溶劑對照組相比，LPS 10 mg·L-1損傷組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6，IL-8和IL-10含量顯著升高（P＜0.01），提示LPS 作用導(dǎo)致A549 細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎癥因子分泌增加（表2）。與LPS 10 mg·L-1損傷組相比較，奧拉帕尼10 和25 μmol·L-1組細(xì)胞培養(yǎng)液中促炎因子IL-6和IL-8含量均降低（P＜0.01），抗炎因子IL-10 含量持續(xù)升高（P＜0.01），提示該藥在10和25 μmol·L-1濃度對LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥損傷有起到保護(hù)作用。

Tab.2 Effect of olaparib on IL-6，IL-8 and IL-10 releasing in A549 cells induced by LPS

2.2 奧拉帕尼對LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8和ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響

與溶劑對照組相比，LPS 損傷導(dǎo)致A549 細(xì)胞內(nèi)TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8 和ICAM-1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與LPS 10 mg·L-1組相比，奧拉帕尼10和25 μmol·L-1保護(hù)組均可顯著降低細(xì)胞內(nèi)TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8 和ICAM-1 mRNA 的表達(dá)（P＜0.01）（表3）。表明該藥可通過下調(diào)相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)而抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

2.3 奧拉帕尼對LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞ROS 生成的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示（圖1），LPS 刺激能誘導(dǎo)A549 細(xì)胞ROS 表達(dá)升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與LPS 10 mg·L-1組相比，該藥10 和25 μmol·L-1保護(hù)組均可顯著降低細(xì)胞ROS 水平（P＜0.01）。表明其可抑制LPS 誘導(dǎo)的A549細(xì)胞氧化損傷。

Fig.1 Effect of olaparib on reactive oxygen species（ROS）level in A549 cells induced by LPS. See Tab.2 for cell treatment. x±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group；##P＜0.01，compared with LPS group.

2.4 奧拉帕尼對LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞PARP-1蛋白表達(dá)和P65，IKKβ和IκBα蛋白磷酸化的影響

Western 印跡結(jié)果顯示（圖2，圖3），與溶劑對照組相比，LPS 刺激能誘導(dǎo)A549 細(xì)胞PARP-1 表達(dá)顯著升高（P＜0.01），并激活NF-κB通路相關(guān)蛋白磷酸化激活，細(xì)胞IKKβ，IκBα和P65磷酸化水平升高（P＜0.01）。與LPS 10 mg·L-1組相比，奧拉帕尼10和25 μmol·L-1能顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞PARP-1 蛋白表達(dá)和NF-κB 通路激活（P＜0.01），降低IKKβ，IκBα 和P65 磷酸化水平（P＜0.01）。提示其可通過抑制PARP-1 蛋白的表達(dá)影響NF-κB 通路的激活，最終抑制了LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

Tab.3 Effect of olaparib on mRNA expression of TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8，and ICAM-1 in A549 cells induced by LPS

Fig.2 Effect of olaparib on protein expression of poly（ADP-ribose）polymerase-1（PARP-1）in A549 cells induced by LPS detected by Western blotting. See Tab.2 for cell treatment. x±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group；##P＜0.01，compared with LPS group.

Fig.3 Effect of olaparib on protein phosphorylation of IκB kinase β（IKKβ），inhibitor of kappa B（IκBα），and P65 in A549 cells induced by LPS detected by Western blotting. See Tab.2 for cell treatment. x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group；##P＜0.01，compared with LPS group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，奧拉帕尼具有抑制LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞炎癥損傷的作用，能顯著降低TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8 和ICAM-1 等炎癥因子的表達(dá)，升高IL-10水平，抑制細(xì)胞ROS的表達(dá)。Western印跡結(jié)果顯示，該藥能通過抑制PARP-1 的表達(dá)而抑制LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥信號通路的活化。

炎癥損傷是眾多肺部疾病的病理基礎(chǔ)，如哮喘，COPD，ALI/ARDS等。其中，ALI/ARDS是一種常見的呼吸危重癥，肺部廣泛炎癥，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷，中性粒細(xì)胞聚集，以及肺泡腔內(nèi)含有蛋白的水腫液集聚是ALI/ARDS的主要病理機制［11］。肺泡上皮細(xì)胞是肺呼吸功能的核心，也是肺部最早受到炎癥攻擊的效應(yīng)細(xì)胞之一，LPS等多種炎癥攻擊因子可直接或間接激活作用于肺上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞大量表達(dá)促炎因子（TNF-α，IL-1β 和IL-6 等），趨化因子（IL-8 等）與黏附分子（ICAM-1等）［12-13］，促進(jìn)包括中性粒細(xì)胞在內(nèi)的眾多炎癥細(xì)胞穿透肺毛細(xì)血管屏障進(jìn)入肺組織繼而進(jìn)一步影響肺泡上皮的結(jié)構(gòu)與功能。TNF-α是炎癥的重要啟動子，是ALI 最先出現(xiàn)的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)IL-1，IL-6和IL-8等炎癥因子的分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［14］。IL-1β是一種調(diào)節(jié)自然免疫的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)調(diào)控其他炎癥因子在多種細(xì)胞中表達(dá)，在炎癥反應(yīng)中起協(xié)同作用［15］。IL-6是啟動全身炎癥反應(yīng)的最強內(nèi)源性炎癥因子，在ALI中，IL-6可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞［16］。IL-8 和ICAM-1對ALI中性粒細(xì)胞的激活及向肺組織聚集具有重要的影響［17］。IL-10 是一種多效細(xì)胞免疫因子，發(fā)揮下調(diào)炎癥反應(yīng)，拮抗炎性介質(zhì)的作用［18］。此外，肺上皮細(xì)胞活躍的代謝功能，特別是表達(dá)、合成和分泌ROS 等氧化損傷因子亦介導(dǎo)ALI/ARDS 疾病病程［19］。本研究結(jié)果顯示，奧拉帕尼可通過抑制TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8和ICAM-1等炎癥因子的釋放，以及促進(jìn)IL-10 等抗炎因子的釋放而緩解LPS誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞損傷，其對細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的調(diào)控可能有助于緩解ALI發(fā)病過程中由于炎癥因子分泌引起的進(jìn)一步炎癥級聯(lián)擴大反應(yīng)，中性粒細(xì)胞聚集和肺組織損傷等。

PARP是一種存在于除酵母外所有真核細(xì)胞核內(nèi)的蛋白酶，具有蛋白修飾和核苷酸聚合作用，在許多生理過程中如染色質(zhì)解聚、DNA 復(fù)制和修復(fù)、基因表達(dá)、細(xì)胞分化、凋亡以及基因轉(zhuǎn)錄中均起重要作用。PARP-1可通過對染色體結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)直接作用于轉(zhuǎn)錄因子；參與如NF-κB等多種炎癥信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控，促進(jìn)TNF-α，IL-1β 和IL-6 等多種炎癥因子及IL-8和ICAM-1等多種趨化因子和黏附分子的表達(dá)［20］。PARP-1 在許多炎癥性疾病，對細(xì)胞壞死和器官衰竭發(fā)揮重要影響，抑制其活性可減少促炎細(xì)胞因子的釋放［21-23］。在動物水平上，通過基因敲除或藥理性抑制PARP-1 的方法，能有效治療ALI等多種炎癥性肺部疾?。?-6］。

NF-κB 是一種廣泛存在各種組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、細(xì)胞黏附分子以及免疫受體等多種靶基因的表達(dá)，而參與宿主的炎癥與免疫反應(yīng)、凋亡與抗凋亡及細(xì)胞增殖分化等生理過程［24］。在哺乳動物中NF-κB 家族中有5 個成員：p50，p52，p65，c-Rel 和RelB，其中p50和p65亞基在所有細(xì)胞都有表達(dá)［25］。靜息狀態(tài)下，NF-κB 通常以p65/p50 異二聚體形式與IκB結(jié)合成三聚體而滯留在胞質(zhì)中，而IκB 的活化則受IKK復(fù)合體的調(diào)控［24］。NF-κB的激活是PARP-1調(diào)控炎癥的中心途徑，活化PARP-1可調(diào)控IKKβ磷酸化激活，生成磷酸化IKKβ（p-IKKβ），p-IKKβ 可進(jìn)一步活化IκBα，使其磷酸化（p-IκBα）而從NF-κB三聚體（p65/p50/IκBα）上脫落，使得NF-κB 由抑制狀態(tài)被激活，NF-κB的p65亞基磷酸化（p-p65）并進(jìn)入細(xì)胞核與DNA 上特異性位點結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫、炎癥等多種靶基因的表達(dá)［26-28］。可見，NF-κB的p65亞基磷酸化激活是細(xì)胞炎癥調(diào)控的重要信號。Western印跡結(jié)果顯示，PARP-1 抑制劑奧拉帕尼可通過抑制細(xì)胞PARP-1 的表達(dá)，繼而抑制IKKβ 和IκBα 的磷酸化激活，再而抑制p65的磷酸化激活，從而下調(diào)了LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞NF-κB信號通路，最終抑制了細(xì)胞的炎癥損傷和炎癥因子的表達(dá)。

綜上所述，奧拉帕尼能抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其抗炎作用機制與抑制PARP-1并調(diào)控NF-κB信號通路的激活密切相關(guān)，有望成為ALI等肺部炎癥性疾病治療的新策略。