張惠子，黃金昶

(1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2.北京中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，北京 100029)

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿，惡性度高，預后差，死亡率高的消化道惡性腫瘤[1]。多數患者診斷時已經是局部晚期或者發(fā)生遠處轉移，失去手術機會，因此吉西他濱成為治療進展期胰腺癌的一線化療藥物，但由于存在原發(fā)或繼發(fā)耐藥性，其臨床療效仍較差[2]。近年來，中西醫(yī)結合治療腫瘤已成為研究熱點，前期的研究已證實單用加味烏梅丸對胰腺癌移植瘤的生長有抑制作用，其抑瘤機制主要是促進腫瘤細胞的凋亡[3]。本研究旨在進一步探討加味烏梅丸聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌移植瘤細胞凋亡的機理。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c-nu/nu裸小鼠，雄性，5～6周齡，體質量(20±2)g，共40只，購于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。

1.2 實驗材料

加味烏梅丸由烏梅50 g，當歸20 g，白芍30 g，細辛3 g，干姜10 g，川椒6 g，桂枝10 g，黃連3 g，黃柏10 g，黨參10 g，制附片(先煎)10 g，炒枳殼10 g，木香10 g，生黃芪30 g，壁虎(剪段)30 g組成，按《中藥藥理研究方法學》[4]附表“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表”計算出裸小鼠的用量，水煎成濃度為2.0 g生藥/mL，高溫滅菌(由中日醫(yī)院煎藥室完成)，4℃?zhèn)溆?；注射用鹽酸吉西他濱(澤菲)，江蘇豪森藥業(yè)；TUNEL試劑盒，羅氏公司。

1.3 造模與分組

人胰腺癌SW1990細胞株[5]在含10%小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，取對數生長的6×107/mL細胞制成單細胞懸液，取0.1 mL接種于裸鼠右腋下，制備皮下移植瘤模型，成瘤率為100%。

將裸鼠按體質量隨機分為4組，每組10只。從接種第2天開始模型組，灌胃生理鹽水0.4 mL/只/天，共21 d；中藥組，灌胃加味烏梅丸0.4 mL/只/天，共21天；化療組，吉西他濱按100 mg/Kg，腹腔注射0.2 mL，每周1次，共2次；中藥+化療組，給藥方法同中藥組、化療組。

2 方法

2.1 瘤體積及瘤質量測量

從第9天開始每4天用游標卡尺測量瘤結節(jié)的最大長徑a、短徑b及高c以計算瘤體積(V=πabc/6)，并繪制腫瘤生長曲線；21天后處死裸鼠，稱取瘤質量，計算抑瘤率(抑瘤率=模型組平均瘤重-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重×100%)，合并用藥效應根據webb氏分數乘積法計算：(fa)1.2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2](fa)1和(fa)2分別為中藥組、化療組的抑瘤率，(fa)1.2為兩組理論相加效應，如果合并用藥的效應大于理論相加效應，則表示有協(xié)同抑瘤作用[6]。

2.2 TUNEL染色

(1)用二甲苯浸洗2次，每次5 min。(2)用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min。(3)用Proteinase K工作液處理組織15～30 min在37℃8 min。(4)PBS漂洗2次。(5)制備TUNEL反應混合液，處理組用50 μLTdT+450 μL標記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50 μL標記的dUTP液，陽性對照組先加入100 μL DNase l，在15～25℃反應10 min，后面步驟同處理組。(6)玻片干后，加50 μLTUNEL反應混合液(陰性對照組僅加50 μL標記的dUTP液)于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37℃反應1 h。(7)PBS漂洗3次。(8)玻片干后加50 μL converter-POD于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37℃反應30 min。(9)PBS漂洗3次。(10)在組織處加50～100 μL DAB底物，15～25℃反應10 min。(11)PBS漂洗3次。(12)拍照后再用蘇木素復染。分化，自來水返藍。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。每張切片在高倍鏡下(40倍)定位，在非壞死區(qū)，隨機選取10個視野，采用image pro plus圖像分析軟件計數凋亡細胞，判斷標準[7]：散在分布，胞核或胞核和胞質同時呈棕黃色，呈典型凋亡形態(tài)特征。

2.3 細胞凋亡基因Bcl-2、Bax蛋白的表達

采用免疫組化SP法染色檢測，具體操作步驟如下：(1)用二甲苯浸洗2次，每次15 min；用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次1 min；(2)PBS漂洗2次；(3)0.3%的H2O2加蓋浸洗15 min；(4)PBS浸洗3次；(5)滴加一抗：鼠抗人Bcl-2、Bax蛋白單克隆抗體稀釋為1∶500，濕盒中4℃冰箱過夜；(6)PBS浸洗3次；(7)滴加二抗：兔抗鼠抗體，濕盒中37℃反應30 min；(8)PBS浸洗3次；(9)浸入DAB工作液中顯色，于光學顯微鏡下觀察；(10)Harris蘇木素復染色15s；(11)自來水洗10 min；(12)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；每張切片在高倍鏡下(40倍)定位，在非壞死區(qū)，隨機選取10個視野，采用image pro plus圖像分析軟件分析每張切片的累積光密度IOD[8]。判斷標準：Bcl-2蛋白在胰腺癌腫瘤細胞中表達于胞漿、核膜等處。Bax蛋白在胰腺癌腫瘤細胞中表達于胞漿等處。陰性：細胞漿和核周無著色；陽性：細胞漿及核周著色為淺黃色或棕黃色、棕褐色。

2.4 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 腫瘤生長曲線

待瘤結節(jié)形成后，測量并計算瘤體積，繪制生長曲線圖。模型組及用藥組移植瘤的體積隨著時間的延長而明顯增加，但用藥組移植瘤的體積增長幅度明顯小于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1)。

圖1 移植瘤生長曲線圖

3.2 瘤質量及抑瘤率

中藥組、化療組和中藥+化療組各組的瘤質量均小于模型組，中藥組、化療組、中藥+化療組的抑瘤率分別為24.36%、48.59%和63.88%。大于其理論相加抑瘤率61.11%，故表明加味烏梅丸與吉西他濱聯(lián)合有協(xié)同抑瘤作用(見表1)。

3.3 凋亡細胞數的結果

與模型組相比，中藥組、化療組和中藥+化療組中呈棕黃色顆粒表達的凋亡細胞數明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；其中中藥+化療組與中藥組和化療組相比，差異亦均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05),表明加味烏梅丸可協(xié)同吉西他濱誘導細胞的凋亡(見表2)。

表1 各組荷瘤鼠的瘤體積和瘤質量的比較

注：與模型組比較，*P<0.05； 與化療組比較，#P<0.05

表2 各組荷瘤鼠腫瘤組織中凋亡細胞數比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與中藥+化療組比較，#P<0.05

3.4 Bcl-2、Bax蛋白表達結果

與模型組相比，中藥組、化療組和中藥+化療組中Bcl-2蛋白表達的著色顆粒明顯減少；差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；其中中藥+化療組累積光密度IOD為最低。而Bax蛋白表達的著色顆粒明顯增多；差異亦均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；其中中藥+化療組與化療組相比，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明加味烏梅丸協(xié)同吉西他濱誘導細胞的凋亡的機制，可能是與凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達下降，凋亡促進蛋白Bax的表達增多有關。見表3，圖2。

表3 各組荷瘤鼠腫瘤組織中Bcl-2、Bax蛋白表達結果

注：與模型組比較，*P<0.05；與中藥+化療組比較，#P<0.05

注:A：模型組；B：用藥組圖2 Blc-2蛋白表達(×40)

4 討論

黃金昶教授認為胰腺癌的病位在肝經，根據厥陰病的陰陽消長規(guī)律，此時為陰氣盡而陽氣始生，故胰腺癌的病機為肝陽虛，寒濕內盛。烏梅丸是治療厥陰病的代表方，臨床上采用加味烏梅丸治療胰腺癌，主要是取烏梅性味酸平，歸肝脾經，肝體陰而用陽，肝主升發(fā)，配當歸、白芍以養(yǎng)肝陰，補肝血；厥陰肝木生于腎水而育心火，故附子補腎之陽，以助肝陽，黨參益肝氣；肝之陽氣在生長階段易郁而化火，故黃連、黃柏清火熱之邪，且黃連配附子，一清瀉一溫引，邪熱可盡；干姜、川椒溫化中焦寒濕；細辛、黃柏合用起沉寒，清濕熱；桂枝溫心陽，推動陽氣上升；加生黃芪補一身之氣血；炒枳殼、木香行氣消脹；而其中壁虎具有軟堅散結、活血化瘀、抗腫瘤的功用，為治療腫瘤的良藥[9]?，F(xiàn)代藥理研究也證實了壁虎的抗腫瘤活性是通過多靶點，多水平共同實現(xiàn)的[10]。

本實驗在前期實驗基礎上增加陽性對照藥物吉西他濱，吉西他濱是目前治療胰腺癌的一線化療藥物，通過實驗可看出中藥+化療的聯(lián)合用藥組對胰腺癌移植瘤有協(xié)同抑瘤作用，這也體現(xiàn)了中藥在配合化療期間的增效優(yōu)勢。此外，實驗也證實了加味烏梅丸的抑瘤作用是通過促進腫瘤細胞凋亡而實現(xiàn)的[3]。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，有別于壞死，是維持機體平衡的重要機制。細胞凋亡在腫瘤發(fā)生，發(fā)展以及在其產生耐藥中發(fā)揮重要作用[11-12]。

然而細胞凋亡是一個多基因參與的、復雜的過程。本實驗為探討加味烏梅丸促進腫瘤細胞凋亡的機理，發(fā)現(xiàn)其中Bcl-2家族的表達與調控是影響細胞凋亡的關鍵因素之一，在細胞凋亡信號傳導途徑中發(fā)揮重要作用[13]。Bcl-2家族分為抑制凋亡和促進凋亡蛋白兩大類，Bcl-2基因是一種對細胞凋亡具有顯著抑制作用的凋亡相關基因。Bax基因抑制Bcl-2的活性，從而發(fā)揮其促進凋亡的作用，Bax和Bcl-2蛋白結構上的特點和相互作用，使二者在細胞內有著密切聯(lián)系，即Bcl-2或Bax異源二聚體形成的調節(jié)是細胞凋亡調控中一個非常重要的環(huán)節(jié)。Bcl-2蛋白水平增高，可抑制細胞凋亡；而Bax蛋白水平增高，可促進細胞凋亡[14-15]。