劉魯峰 寸海春 何鵬飛 狄義寧 吳毅歆 何麗蓮 李富生 何月秋

摘 ?要 ?為探究甘蔗內生菌多樣性組成及相關特性，本研究采用稀釋涂板法分離并結合形態(tài)觀察和分子標記（gyrB， rpoB， ITS， 16S rDNA）進行鑒定。結果表明，從12個栽培品種（系）和5個野生種無性系的根、莖、葉組織中共分離到細菌589株、放線菌34株和真菌46株;細菌中固氮菌有41株，溶磷菌有98株，解鉀菌有52株，對黃曲霉和禾谷鐮刀菌具有拮抗作用分別有44株和35株。內生細菌分屬21個屬，其中芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬為優(yōu)勢屬;內生真菌分屬于枝頂孢屬、鏈格孢屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、枝孢屬等17個屬，而放線菌僅為鏈霉菌屬。具有潛在植物益生功能的菌株主要集中在芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、類芽孢桿菌屬及泛菌屬。本研究顯示甘蔗栽培品種（系）和野生種無性系均含有豐富的內生菌資源，且栽培品種（系）所含內生菌在數(shù)量和多樣性上均高于野生種無性系;12個栽培品種（系）間所分離到的內生細菌大部分相同，但也存在差異。通過初步的功能鑒定，篩選出一些具有應用潛力的益生微生物，為開發(fā)相應功能的生物菌劑奠定基礎。

關鍵詞 ?甘蔗;內生菌;分離;鑒定;功能多樣性

中圖分類號 ?S566.1 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?To investigate the diversity composition of sugarcane endophytes and the beneficial characteristics， dilution-plating， morphological observation and molecular marker （gyrB [gyrase beta-subunit]， rpoB [RNA polymerase beta-subunit]， ITS [integrated transcribed space]， 16S rDNA） were used in the combination and several room assays such as phosphate-， potassium-solubilizations and antagonistism tests. The results showed that 589 bacterial， 34 actinomycetic and 46 fungal strains were isolated from the root， stem and leaf tissues of 12 sugarcane varieties and 5 wild species， of which 41 strains could fix nitrogen， 98 and 52 strains solubilize phosphate and potassium respectively， 44 and 35 strains were antagonistic to Aspergillus flavus and Fusarium graminearum， respectively. The endophytic bacteria belonged to 21 genera， among them Bacillus， Burkholderia， Enterobacter and Pantoea were the dominant. The endophytic fungi were classified into 17 genera， Acremonium， Alternaria， Aspergillus， Ceriporia， Cladosporium， etc.， while actiomycetes was Streptomyces only. The strains with plant beneficial potentials were mainly clustered into Bacillus， Burkholderia， Enterobacter， Pseudomonas， Acinetobacter， Paenibacillus and Pantoea. The study showed rich endophyte resources both in the sugarcane varieties and wild species interior， and the number and diversity of endophytes in the cultivated varieties were higher than that of wild species. Most of the endogenous bacteria isolated from 12 sugarcane cultivars were the same， but there were differences. Through preliminary functional identification， some probiotics with application potential were screened out， which laid a foundation for the development of biological agents with corresponding functions.

Keywords ?sugarcane; endophytic microbe; isolation; identification; functional diversity

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.016

植物內生菌是指生活史中某一段生活在植物組織內，對植物沒有明顯病害癥狀的一類微生物，主要包括內生細菌、內生真菌和內生放線菌[1-2]。19世紀中期，人們就開始了對植物內生菌的初步探索和研究，直到1977年Bacon等發(fā)現(xiàn)高羊茅內生真菌與牛的中毒癥狀有關之后[3]，植物內生菌的研究工作才引起廣泛的關注。特別是1993年Stierle首次報道了從短葉紫杉的韌皮部分中分離出一株內生真菌（Taxomyces andreanae）能產(chǎn)生紫杉醇[4]，再次掀起了研究植物內生菌的熱潮。目前各國科研人員已在80多個屬中290多種禾本科植物發(fā)現(xiàn)有內生菌，在農(nóng)作物和經(jīng)濟作物中的內生細菌已超過129種，54個屬被報道，發(fā)現(xiàn)的內生細菌主要集中在芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）等[5]。內生真菌則主要集中在子囊菌類（Ascomycet）及其無性型[6]，內生放線菌則以鏈霉菌屬（Streptomyces）、諾氏卡菌屬（Nocardia）、小單胞菌屬（Micromonospora）為主[7]。

植物內生菌可以通過提高營養(yǎng)物質及礦物質的循環(huán)利用促進植物生長，改善土壤條件，提高化肥利用率，保護植物免受病原菌的侵害。目前研究表明植物內生菌具有固氮、溶磷和解鉀功能，尤其是固氮作用研究較多，而內生固氮菌多為內生固氮細菌，大多分離自健康植物組織器官中，主要包括固氮螺菌（Azospirillum spp.）、重氮營養(yǎng)醋桿菌（Acetobacter diazotrophicus）、多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、克雷伯氏菌（Klebsiella spp.）、成團腸桿菌（Enterobacter agglomerans）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、草螺菌（Herbaspirillum spp.）、固氮弧菌（Azoarcus spp.）、糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）、伯克霍爾德氏菌（Burkholderia spp.）等[8]。而溶磷和解鉀微生物更多的是從植物根際土壤中進行篩選分離得到，從植物中分離溶磷和解鉀內生菌的研究相對較少。Chen等[9]從北京官廳水庫的水生植物蘆葦、菹草、睡蓮和茨藻中分離獲得了36株具有溶磷作用的細菌;郭瑩等[10]從寒區(qū)富營養(yǎng)化水體中的健康穗花狐尾藻植株內分離獲得了一株具有溶磷作用的沙雷氏菌屬內生菌SP5。有時也能分離到兼具固氮溶磷解鉀的多功能菌株，如陽潔等[11]從廣西藥用野生稻（Oryza officinalis）中篩選出4株具有高效溶磷解鉀的內生固氮菌。

植物內生菌在拮抗病原菌方面的研究也取得了長足進展。Strobel團隊和Li團隊分別證實了從雷公藤分離到的內生真菌Cryptosporiopsis cf. quercina對核盤菌、灰葡萄孢和稻瘟病菌等多種植物病原微生物有拮抗作用[12-13]。何紅等從辣椒中分離到的108株內生細菌有約1/4的菌株對香蕉枯萎病菌、黃瓜枯萎菌有拮抗作用，其中1株枯草芽孢桿菌對植物炭疽病菌和番茄青枯病菌等有強烈的抑制作用[14-15]。袁軍等從馬鈴薯中分離到40株內生細菌對環(huán)腐病菌有不同程度的拮抗作用[16]。Mitchell等從野生鳳梨中分離的內生真菌Muscodor crispans不僅對植物病原菌腐霉、樟疫霉、核盤菌、球腔菌有抗菌活性，對人的病原菌鼠疫桿菌、結核分枝桿菌和葡萄球菌也有抗菌活性[17]。王霞等從植物菘藍中對分離到4株對植物病原菌禾谷鐮刀菌、鏈格孢霉、大斑凸臍蠕孢有很強拮抗活性的內生細菌[18]。研究人員還從棉花、大蒜、酸棗等植物中分離到大量對病原菌有拮抗作用的內生菌。

甘蔗是重要的糖料作物和能源作物，甘蔗內生菌最早發(fā)現(xiàn)于1961年，迄今已有10種以上的內生菌種屬在美洲、澳洲和亞洲甘蔗體內被分離，國內外甘蔗內生菌研究大部分集中在固氮菌方面[19-21]，與甘蔗有關的溶磷解鉀菌大多分離自甘蔗根際土壤[22]。學者們主要從甘蔗的根際土或根或莖葉中分離甘蔗內生細菌[23-25]，對于甘蔗內生真菌及放線菌的分離研究較少，同時從甘蔗野生種及栽培種分離內生菌鮮有報道。我國甘蔗內生菌相關研究起步較晚，迄今為止未分離到適合我國生態(tài)條件下的穩(wěn)定高效甘蔗內生菌互作模式菌株，而從國外引進的具良好特性的甘蔗品種在我國種植也難以獲得在其原產(chǎn)地同樣的高促生效率[26]。因此本研究從12個栽培品種（系）及5個野生種無性系的根、莖、葉中分離內生真菌、細菌、放線菌，并對分離到的內生菌進行分子鑒定，初步探討甘蔗野生種及栽培種根、莖、葉部內生菌的多樣性，并獲得具有應用價值的益生微生物，為后續(xù)甘蔗的病蟲害防治以及促生抗逆提供優(yōu)良的菌種資源儲備。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

植物材料：12個甘蔗栽培品種/系——新臺糖10、新臺糖22、粵糖86-368、粵糖93-359、桂糖11、云蔗99-91、閩糖69-421、崖城89-9、滇蔗01-47、滇蔗01-58、滇蔗04-14、滇蔗09-38，代號分別設為ROC10、ROC22、YT86、YT93、GT11、YZ99、MT69、YC89、DZ47、DZ58、DZ14、DZ38;5個甘蔗野生資源無性系——割手密（Saccharum ?spontaneum）、斑茅（Saccharum arundinaceum）、蔗茅（Erianthus fulvus）、五節(jié)芒（Miscanthus floridulus）、河八王（Saccharum narenga），代號分別設為SS、SA、EF、MF、SN。這些材料均種植于云南農(nóng)業(yè)大學甘蔗研究所資源圃。

菌株：植物病原真菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）及黃曲霉菌（Aspergillus flavus）、洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）1-2菌株，均保存于本實驗室。

培養(yǎng)基：LB固體及液體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基[27]、察氏（Czapek）培養(yǎng)基[27]、NBRIP培養(yǎng)基[10]、Pikovskaya（簡稱PVK）培養(yǎng)基[28]、Ashby無氮培養(yǎng)基[29]及Aleksandrov培養(yǎng)基[30]分別用于細菌、真菌及放線菌分離擴繁，以及解無機磷、固氮、解鉀和拮抗試驗。

1.2 ?方法

1.2.1 ?內生菌的分離純化及形態(tài)觀察 ?采用研磨稀釋涂板法分離不同甘蔗品種和野生無性系植株健康組織內部的微生物。從一年生宿根甘蔗分蘗期植株上分別剪取健康的根、莖及葉組織，用毛筆輕輕刷除其上所附著的土壤顆粒，隨后使用自來水沖洗2～3 min以去除表面多余的雜質，濾紙吸干表面水分。取上述預處理過的各組織1.0 g，用75%酒精浸泡根組織3 min，莖、葉組織1 min;再用1% NaClO溶液消毒根組織6 min，莖、葉組織3 min;再用無菌水各漂洗6次以除去消毒劑;最后使用無菌濾紙吸干殘留的水分。吸取最后一次漂洗的無菌水100 μL涂布于PDA、LB和高氏一號培養(yǎng)基平板，驗證消毒效果。將消毒好的組織樣品放入無菌研缽中，并向其內加入9 mL無菌水，研磨至成勻漿狀，然后10倍梯度稀釋，取一定體積的適當梯度稀釋液至PDA、LB和高氏一號固體培養(yǎng)平板上，均勻涂布，最后置于適宜的溫度下培養(yǎng)。挑選菌落形態(tài)不同的單菌落純化，并將形態(tài)大部分相似的菌落劃歸為同一類，保存菌株備用。

1.2.2 ?具有溶磷、解鉀或固氮活性內生細菌的平板篩選 ?從–80?℃冰箱中取出內生細菌的甘油貯液，室溫放置，待其呈熔融狀態(tài)。在超凈臺上用無菌牙簽蘸取少許甘油菌液，分別點接于無氮Ashby、PVK溶磷或解鉀固體平板上，置于30?℃恒溫箱中倒扣培養(yǎng)4～5?d;以溶磷細菌洋蔥伯克霍爾德氏菌1-2菌株為正對照，觀察菌落周圍有無水解圈的出現(xiàn)，測量菌落直徑的大小并將其與對照菌株作比較，初步判斷內生細菌的固氮、溶磷及解鉀能力，并做好相關記錄和拍照留存。

1.2.3 ?拮抗禾谷鐮刀和黃曲霉菌的內生細菌篩選 ?（1）平板點菌初篩。從–80?℃冰箱中取出粘有禾谷鐮刀菌菌絲或黃曲霉菌分生孢子的濾紙片，分別置于PDA平板中央，25～28?℃培養(yǎng)3～5 d以活化病原真菌;使用無菌接種針在活化菌落的邊緣挑取含有菌絲的瓊脂塊，轉接于盛有20 mL液體Czapek培養(yǎng)基的50 mL規(guī)格三角瓶中，28?℃，150 rpm振搖培養(yǎng)5 d;血球計數(shù)板計數(shù)，使用無菌水將其孢子濃度調整為106 CFU/mL，用移液器吸取200 μL上述調整后的菌絲體（或分生孢子）溶液，均勻涂布于PDA平板;用無菌牙簽蘸取少許內生細菌的甘油菌液，點接于上述PDA平板，每株細菌點取3次;28?℃恒溫培養(yǎng)3～5?d，觀察點菌處有無明顯的抑菌圈。根據(jù)抑菌圈的有無及大小初篩出具有拮抗活性的內生細菌。（2）平板對峙復篩。仿上述操作活化禾谷鐮刀菌或黃曲霉菌。使用0.5 mm打孔器打取菌絲塊，無菌接種針挑取菌絲塊轉接并倒貼于新鮮制備的PDA平板（9.0 cm）中央處，同時用無菌牙簽蘸取初篩出的甘油菌液，四點法點接于距離病原菌絲塊中心3.0 cm處;28?℃培養(yǎng)3～5 d后，測量病原真菌的菌落直徑及內生細菌的菌落大小，進一步復篩出具有較強拮抗活性的內生細菌。以未接內生細菌的病原真菌平板為空白對照。

1.2.4 ?甘蔗內生菌的分子鑒定 ?內生細菌基因組DNA的提取參考Cheng[31]提出的方法，內生真菌的基因組DNA提取方法采用EDTA-SDS方法[29]，內生放線菌鑒定所用的DNA模板按如下步驟制備：用一無菌牙簽挑取單菌落，轉入含有27 μL TE緩沖液的無菌離心管內，充分分散混勻;隨后向離心管內加入27 μL KOH（0.4 mol/L）- EDTA（10 mmol/L）裂解液，70?℃水浴5 min;水浴結束后，向上述混合反應液加入3 μL Tris-HCl（pH 4.0）以中和裂解液，12000 r/min室溫離心5 min，此時的上清液即可作為PCR的DNA模板。

使用gyrB和rpoB基因PCR及測序鑒定內生細菌的種屬地位[32]，真菌和放線菌鑒定所用的分子標記則分別是ITS[33]和16S rDNA[34]。除了擴增引物有所差異外，三者鑒定所配制的PCR體系完全相同，具體如下（以20 μL為例）：無菌ddH2O

13.7 μL，10×EasyTaq buffer （+Mg2+）2.0 μL， dNTPs 1.6 μL，上下游引物各1.0 μL，EasyTaq DNA聚合酶 0.2 μL，基因組DNA模板0.5 μL。PCR程序參數(shù)如下：94?℃預變性270 s，30個循環(huán)體（94?℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72?℃延伸90 s，真菌ITS擴增的延伸時間為45 s），72?℃最終延伸10 min，16?℃保存。PCR結束后，點樣于0.8%瓊脂糖凝膠上，90 V電泳40～50 min，凝膠成像觀察條帶有無及正確與否。最后送交符合預期的PCR產(chǎn)物樣品至昆明碩擎生物公司測序。將測序結果與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關同源序列比對，根據(jù)序列的一致性，確定內生菌的種屬分類。

2 ?結果與分析

2.1 ?內生菌的分離純化及形態(tài)觀察通過組織表面消毒及研磨稀釋的分離與后續(xù)純化操作，從包括野生資源在內的17份甘蔗材料中共計分離到589株細菌、34株放線菌和46株真菌。從不同組織分離的內生菌數(shù)量表現(xiàn)為根>莖>葉。根據(jù)菌落形態(tài)、背面色澤等指標，初步將所分離到的589株細菌劃歸為161類，放線菌劃分成6類。部分內生菌的室內培養(yǎng)形態(tài)如圖1所示。

2.2 ?具有溶磷、解鉀或固氮活性內生細菌的平板篩選通過在上述相應的檢測平板上點菌，發(fā)現(xiàn)部分甘蔗內生菌至少有溶磷、固氮或解鉀活性的一種或多種。根據(jù)平板點菌結果，顯示具有溶磷、

1～6：生長于LB平板的內生細菌; 7～12：生長于PDA平板的內生真菌; 13～18：高氏培養(yǎng)基上的內生放線菌。固氮或解鉀活性的內生細菌分別有98、41及52株。與伯克霍爾德氏1-2菌株相比，某些甘蔗內生細菌的溶磷圈直徑與之相當（圖2 B）。另外還有些細菌雖無法在NBRIP、Ashby或Aleksandrov平板上形成透明圈，但是菌落直徑較大或隆起，生物累積量較大，顯示其可能也具有一定的溶磷、固氮或解鉀活性（圖2）。

2.3 ?拮抗禾谷鐮刀和黃曲霉菌的內生細菌篩選通過在含有相應病原真菌培養(yǎng)基的平板上點菌，初步統(tǒng)計，能抑制黃曲霉的有44株，能抑制禾谷鐮刀菌的35株（圖3）。

2.4 ?甘蔗內生菌的分子鑒定序列擴增后均得到單一且明亮的條帶，與預期大小一致。將所獲得的所有序列片段與NCBI中已知序列進行Blast比對，內生細菌有21個屬（表

1）。內生真菌有17個屬，分別為枝頂孢屬（Acremonium）、鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、臘孔菌屬（Ceriporia）、枝孢屬（Cladosporium）、粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）、鬼傘屬（Coprinellus）、間座殼屬（Diaporthe）、鐮刀菌屬（Fusarium）、赤霉菌屬（Gibberella）、耙齒菌屬（Irpex）、青霉菌屬（Penicillium）、平革菌屬（Phanerochaete）、射

A：Ashby無氮平板;B：含有25 mg/L溴酚藍的PVK平板;C：含有25 mg/L溴酚藍的解鉀平板。

2.5 ?甘蔗內生菌在不同品種（系）中分布情況在細菌的21個屬中，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬，其次為伯克氏菌屬，緊接著為腸桿菌屬和泛菌屬;栽培種分離到的菌株多于野生種，且分離頻次平均高35.8%（表1）。分離到的17個內生真菌屬中鐮刀菌屬為優(yōu)勢屬，甘蔗栽培種中分離到的菌株也是多余野生種，其中從崖城89-9栽培種中分離到的屬種類最多（表2）。氮的有11株，解磷的有16株，解鉀的有8株;芽孢桿菌屬固氮、溶磷、解鉀的分別有5、32、11株，抑制黃曲霉的有32株，抑制禾谷鐮刀菌的有15株。

3 ?討論

在甘蔗中，只是單方面的從栽培品種或甘蔗植株中的某一個組織中分離內生菌，大部分的研究主要是集中在固氮菌以及促生長的研究上[35]，盡管現(xiàn)在大家對微生物的興趣日益濃厚，但大多數(shù)研究僅限于土壤和根系樣本或莖部，此外都是比較有目的性的分離內生細菌，對于真菌及放線菌的分離報道也比較少。本研究為了盡可能多分離到多樣性的可培養(yǎng)內生菌，采用了非選擇性和選擇性培養(yǎng)基相結合的方法同時對野生種及栽培種內生菌進行分離、純化。獲得的內生細菌和真菌分屬于21個屬和17個屬，顯示了較為豐富的多樣性，而內生放線菌僅為單一的鏈霉菌屬。栽培品種（系）所含內生菌在數(shù)量和多樣性上均高于野生種無性系，但野生種中也分離到栽培種中沒有的短波單胞菌屬。這些差異將有助于推動對野生種內生菌的研究。這與譚志遠等[36]、王麗等[23]、胡春錦等[26]分離到的內生菌存在一定差異，可能是所用的培養(yǎng)基、生長地域、采樣時間、種質資源、宿根年限、采樣部位等不同所造成的。今后還有待于對原生境中的野生種內生菌進行分離鑒定，與資源圃保種中的進行比較研究，從而進一步認識內生菌在不同地域環(huán)境中的聯(lián)系和變化。同時下一步有必要研究親本和后代之間的內生菌的關聯(lián)，從而從遺傳關系上尋找內生菌與甘蔗互作的規(guī)律。當然要比較客觀反映內生菌群多樣性，還需借助宏基因組學等方法對不可培養(yǎng)的內生菌群進行分析研究[37-38]。

在生防菌中，芽孢桿菌屬是非常有應用前景的[39-41]一大類。特別是枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌對環(huán)境安全，具有良好的定殖能力且能保護植物免受病原真菌的侵害[42]，還有促生長的作用[43]。目前伯克霍爾德氏菌屬在內生菌中占據(jù)著很重要的位置。Luvizotto 等[44]從巴西甘蔗根部分離到的內生細菌中有39株為伯克氏菌屬細菌，它們在固氮、溶磷、產(chǎn)吲哚乙酸及產(chǎn)嗜鐵素方面至少占有雙重功能。Lin等[45]研究表明腸桿菌屬細菌可以固定空氣中游離氮以及促進甘蔗生長并提高甘蔗產(chǎn)量。Mehnaz等[46]發(fā)現(xiàn)巴基斯坦的甘蔗中分離出的內生腸桿菌屬占據(jù)主導地位。Taulé等[47]也證明烏拉圭的甘蔗植株中，腸桿菌屬也是內生菌中一個重要組成部分。Tam等[48]認為腸桿菌屬、無色細菌屬及泛菌屬內生菌，有利于甘蔗在貧瘠的磚紅壤土及強淋溶土中生長。Mendes等[49]從巴西甘蔗根和莖內分離到4個菌屬內生菌中以伯克霍爾德菌屬為優(yōu)勢菌群。Roci等[50]在墨西哥甘蔗栽培種中分離到伯克霍爾德菌的多個種類，并在促進植物生長方面具有潛能。本研究的結果與前人研究結果相似[51-52]，芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、不動桿菌屬、土壤桿菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬及根瘤菌屬在大部分甘蔗品種均能高頻率地分離到。固氮、溶磷、解鉀、拮抗等功能菌株也主要集中在芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、類芽孢桿菌屬及泛菌屬，可見厚壁菌門和變形菌門中的主要類群可能對植物的生長發(fā)育、增強抗性等發(fā)揮較大的作用，也是甘蔗生產(chǎn)上最有應用潛力的類群。本研究分離獲得的功能菌株大多數(shù)生長速度較快，有部分菌株兼具固氮、溶磷、拮抗等功能，其在根際土壤中的存活定居的可能性大，將來有可能開展這些菌株對甘蔗的實際促生長效應、生態(tài)安全評估和最佳的生長條件進行研究，從而為下一步制成可施用于蔗田的菌劑產(chǎn)品儲備菌種資源。

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