王朋寶，張晶晶，石菁，王威，曹智，張金文

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

油菜(Brassicanapus)屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)，是產(chǎn)油效率較高的油料作物，菜籽油產(chǎn)量占到我國油料作物總產(chǎn)油量的一半以上.栽培油菜主要分為白菜型、芥菜型和甘藍(lán)型3種，其中甘藍(lán)型油菜是全世界種植面積最廣，產(chǎn)量最大的油菜類型[1].它的籽粒中含有相當(dāng)豐富的脂肪酸和蛋白質(zhì)，生長過程需要大量的磷素供給，其供應(yīng)正常與否對(duì)油菜的生長發(fā)育以及最終產(chǎn)量和品質(zhì)都有很大影響[2,3].若磷素缺乏會(huì)導(dǎo)致其品質(zhì)降低，產(chǎn)量大幅下降.前人研究發(fā)現(xiàn)，土壤中有效磷的含量越高，油菜各個(gè)器官中的含磷量也就越高，并且莖與葉的含磷量始終大于根[4].但是土壤中的有效磷含量非常低，大約在0.02%～0.2%之間[5]，絕大多數(shù)磷素都以有機(jī)態(tài)植酸形式存在，需要經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化才能被作物直接吸收利用.農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，雜草防治也是一項(xiàng)亟待解決的問題.雜草造成的直接經(jīng)濟(jì)損失巨大，大約可以占到農(nóng)作物總產(chǎn)值的1/5[6].我國50%～90%的油菜易發(fā)生草害，常年造成減產(chǎn)15%～20%，因此，防治草害對(duì)油菜生產(chǎn)有十分重要的意義[7].隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，農(nóng)業(yè)勞動(dòng)力數(shù)量急劇下降及成本不斷上漲，致使傳統(tǒng)的人工除草已不能合理的跟上生產(chǎn)步伐，高效除草方法已經(jīng)成為迫切需求.抗除草劑作物儼然是一種較佳選擇.張瑜等[8]成功從抗草甘膦油菜DNA中擴(kuò)增得到EPSPS基因，以期用于油用亞麻抗除草劑的研究.May等[9]將CP4EPSPS基因?qū)搿孀置?12’，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生了草甘膦抗性.萬麗麗等[10]構(gòu)建了PCAMBIA-GOX-CP4EPSP植物雙元表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜并獲得轉(zhuǎn)基因植株，該轉(zhuǎn)基因株系可在噴施400倍農(nóng)達(dá)的條件下存活.Mudge等[11]將植酸酶基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的磷素吸收效率和植物生物量顯著高于野生型.Hong等[12]用甘薯的貯藏蛋白啟動(dòng)子在馬鈴薯中超表達(dá)具有酸性磷酸酶和植酸酶活性的基因，獲得的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株可在以植酸作為唯一磷源時(shí)增加對(duì)磷的吸收.因此為同時(shí)解決甘藍(lán)型油菜生長過程中的草害及有效磷匱乏問題，本試驗(yàn)構(gòu)建了含有草甘膦抗性基因和植酸酶基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，以期得到高效磷素吸收利用兼有草甘膦抗性的甘藍(lán)型油菜新材料，并為甘藍(lán)型油菜種質(zhì)創(chuàng)新提供相關(guān)理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)所用植物材料均為本實(shí)驗(yàn)室保存的甘藍(lán)型油菜，主要包括新疆農(nóng)科院自育自交系(‘新疆21109’)、‘隴油10號(hào)’恢復(fù)系C20(‘隴上東’)和‘青雜5號(hào)’恢復(fù)系(‘1831R’).

1.2 質(zhì)粒和主要試劑

質(zhì)粒pMD-nos(含nos終止子)、根癌農(nóng)桿菌LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)以及植物表達(dá)載體pCEPSP(本實(shí)驗(yàn)室用草甘膦抗性基因(EPSPS)替換pCMBIA1300中的潮霉素抗性基因(hyg)所得)均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物代謝功能基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pTOPO-EPSPS(含CP4EPSPS基因)由甘肅省農(nóng)科院張建平研究員饋贈(zèng)，質(zhì)粒PGA1611-E-PhpAO(含phyA基因)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所陳茹梅研究員饋贈(zèng).PCR及qRT-PCR引物合成及DNA序列測(cè)定由蘇州金唯智生物科技(蘇州)有限公司完成；限制性內(nèi)切酶、普通瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒均購自北京全式金生物(北京)技術(shù)有限公司；普通測(cè)序載體pMD19-T、T4 DNA連接酶、標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker和高保真DNA酶(PrimeSTAR HSRDNA Ploy-merase)均購自；其他藥品試劑均是進(jìn)口或國產(chǎn)分析純.

1.3 rbcS的生物信息學(xué)分析

登錄網(wǎng)站GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，檢索油菜Rubisco小亞基(rbcS)序列(ID：X07367.1).通過CBS Predition servers(http://www.cbs.dtu.dk/services)中的TargetP 1.1 Server和ChloroP 1.1 Server預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位、編碼氨基酸序列中的轉(zhuǎn)運(yùn)肽及其剪切位點(diǎn).

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)表達(dá)載體的酶切位點(diǎn)，并參照nos基因序列(ID：AF485783)、eCTP基因序列(ID：X07367.1)、EPSPS基因序列(ID:KJ701603.1)、Pht1;2基因序列(ID：AT5G43370)、phyA基因序列(ID：AF353576.1)和Actin2.1基因序列(ID：FJ529167.1)，采用Oligo7設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物和qRT-PCR引物.

表1 引物序列

小寫部分為保護(hù)堿基，短下劃線部分為酶切位點(diǎn)，加粗部分為kozka序列，長下劃線互為重疊部分.

The lower case is the protectived base,the short underlined parts are the cleavage site，the bold part is the kozka sequence，and the long underline are the overlapping parts.

1.5 目的基因克隆

以質(zhì)粒pMD-nos為模板，采用特異性引物對(duì)N1/N2亞克隆nos終止子；以甘藍(lán)型油菜RG2 cDNA為模板，采用特異性引物對(duì)C1/C2克隆葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽eCTP；以質(zhì)粒pTOPO-EPSPS為模板，采用特異性引物對(duì)E1/E2亞克隆EPSPS基因；以提取的野生型擬南芥DNA為模板，采用特異性引物對(duì)P1/P2克隆根特異性啟動(dòng)子Pht1;2；以質(zhì)粒PGA1611-E-PhpAO為模板，采用特異性引物對(duì)A1/A2亞克隆phyA基因；以回收的EPSPS基因和eCTP為模板，采用特異性引物對(duì)C1/E2，運(yùn)用重疊PCR方法擴(kuò)增融合片段L；利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別與pMD19-T連接，送至江蘇金唯智生物公司進(jìn)行測(cè)序，分別將含有目的片段的正確重組子命名為pMD-nos、pMD-eCTP、pMD-EPSPS、pMD-Pht1;2、pMD-phyA、pMD-L.

1.6 植物表達(dá)載體構(gòu)建

采用酶切連接的方法，依次在基礎(chǔ)載體pCEPSP中插入nos終止子、融合片段L、根特異性啟動(dòng)子Pht1;2及植酸酶基因phyA，最終構(gòu)建獲得了植物重組表達(dá)載體pC-NLTA(圖1)，并利用凍融轉(zhuǎn)化法將其整合到農(nóng)桿菌LBA4404中，提取陽性菌落質(zhì)粒，用特異性引物對(duì)P1/P2、C1/E2、A1/A2進(jìn)行PCR鑒定，將陽性農(nóng)桿菌工程菌保存，用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化.

圖1 表達(dá)載體示意圖Figure 1 Schematic representation of expression vectors

1.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化及鑒定

以甘藍(lán)型油菜品種‘新疆21109’、‘隴上東’和‘1831R’無菌苗莖段為受體材料進(jìn)行侵染.首先截取長約5～7 mm的無腋芽莖段，置于培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d；使用培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(D600=0.5)的農(nóng)桿菌工程菌侵染5～8 min后，擦干外植體外部多余菌液，接種到共培培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d；隨后接種至脫菌培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和脫菌；4周后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基促進(jìn)分化，3周后轉(zhuǎn)接至篩選培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)分化出芽；當(dāng)芽長約2 cm時(shí)，切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根.最后，對(duì)成活的抗性植株進(jìn)行分子檢測(cè).試驗(yàn)所用不同培養(yǎng)基的成分及配比見表2.

表2 甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

1.8 轉(zhuǎn)基因植株靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性植株中植酸酶基因phyA和草甘膦抗性基因EPSPS的表達(dá).采用TRIzol法提取轉(zhuǎn)基因植株總RNA，用QuantScript RT Kit cDNA試劑盒合成cDNA第1鏈，將cDNA樣品稀釋8倍作為模板上機(jī)檢測(cè)，以油菜Actin2.1為內(nèi)參基因(ID：FJ529167.1)，設(shè)3次重復(fù)，應(yīng)用公式2-ΔΔCt計(jì)算在樣本處理前后的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=(ΔCt處理樣品-ΔCtActin2.1)-(ΔCt對(duì)照樣品-ΔCtActin2.1)[13].

2 結(jié)果與分析

2.1 rbcS的生物信息學(xué)分析結(jié)果

TargetP 1.1 Server分析結(jié)果見表3，結(jié)果顯示rbcS序列共編碼181個(gè)氨基酸，cTP、mTP、SP及other分?jǐn)?shù)分別為0.737、0036、0.249和0.068.預(yù)測(cè)定位在葉綠體，可信程度為3，前序長度可能為54個(gè)氨基酸長度.ChloroP 1.1 Server分析結(jié)果見表4，結(jié)果顯示rbcS序列共編碼181個(gè)氨基酸，第二步網(wǎng)絡(luò)的輸出分?jǐn)?shù)0.581，預(yù)測(cè)序列中含有轉(zhuǎn)運(yùn)肽cTP，且建議切割位點(diǎn)評(píng)分為6.923，cTP長度為54個(gè)氨基酸長度.在此基礎(chǔ)上，再結(jié)合NCBI注釋，本試驗(yàn)采用rbcSN端的77個(gè)氨基酸編碼序列為候選片段，堿基長度共231 bp，將其命名為eCTP.

表3 TargetP 1.1 Server分析結(jié)果

表4 ChloroP 1.1 Server分析結(jié)果

2.2 目的基因的克隆

分別以質(zhì)粒pMD-nos、pTOPO-EPSPS和PGA1611-E-PhpAO為模板，特異性引物對(duì)N1/N2、E1/E2和A1/A2亞克隆得到了nos終止子(圖2-A)、EPSPS基因(圖2-C)和phyA基因(圖2-F)；分別以野生型擬南芥的DNA和甘藍(lán)型油菜RG2 cDNA為模板，特異性引物對(duì)P1/P2和C1/C2克隆得到了根特異性啟動(dòng)子Pht1;2(圖2-E)和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽eCTP(圖2-B)；以回收的EPSPS基因和eCTP為模板，采用特異性引物對(duì)C1/E2，運(yùn)用重疊PCR方法，得到了融合片段L(圖2-D)；以上各基因擴(kuò)增片段大小均與預(yù)期相符，測(cè)序結(jié)果顯示與GenBank中注冊(cè)序列同源性較高.

M：DNA Marker；A/B/C/D/E/F-1、2、3：PCR產(chǎn)物M:DNA Marker；A/B/C/D/E/F-1，2，3:PCR products圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Figure 2 PCR amplification products

2.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑菌抽提質(zhì)粒，送至江蘇金唯智生物公司進(jìn)行測(cè)序，分別將含有正確目的片段的重組子命名為pMD-NOS、pMD-eCTP、pMD-EPSPS、pMD-L、pMD-Pht1;2和pMD-phyA，再經(jīng)PstⅠ和HindⅢ(圖3-A)、KpnⅠ和PstⅠ(圖3-B)、SacⅠ和HindⅢ(圖3-C)、XhoⅠ(圖3-D)、SacⅠ和SmaⅠ(圖3-E)、SmaⅠ和XbaⅠ(圖3-F)等限制性內(nèi)切酶酶切后得到的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符.

用HindⅢ和PstⅠ同時(shí)酶切pMD-NOS和載體pCEPSP，用T4連接酶連接，得到載體命名為pC-N，用HindⅢ和PstⅠ雙酶切檢測(cè)(圖4-A)，證明成功構(gòu)建載體pC-N；用XhoⅠ同時(shí)酶切pMD-L和載體pC-N，回收目的條帶，用T4連接酶連接，得到載體命名為pC-NL，用XhoⅠ酶切檢測(cè)(圖4-B)，結(jié)果表明已成功構(gòu)建載體pC-NL.用SacⅠ和SmaⅠ同時(shí)酶切pMD-Pht1;2和載體pC-NL，回收目的條帶，用T4連接酶連接，得到載體命名為pC-NLT，用SacⅠ和SmaⅠ雙酶切檢測(cè)(圖4-C)，證明成功構(gòu)建了載體pC-NLT.用SmaⅠ和XbaⅠ同時(shí)酶切pMD-phyA和載體pC-NLT，回收目的條帶，用T4連接酶連接，得到載體命名為pC-NLTA，用SmaⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測(cè)(圖4-D)，證明成功構(gòu)建了pC-NLTA載體.

M：DNA Marker；A-1,2/B-1,2/C-1,2/D-1/E-1,2,3,4/F-1,2：酶切產(chǎn)物.M:DNA Marker；A-1,2/B-1,2/C-1,2/D-1/E-1,2,3,4/F-1,2:Restriction products.圖3 重組子雙酶切驗(yàn)證Figure 3 Recombinant double enzyme digestion verification

M：DNA Marker；A-1：酶切產(chǎn)物；B-1/C-1/D-1：載體質(zhì)粒；B-2、3/C-2、3/D-2、3：酶切產(chǎn)物.M:DNA Marker；A-1:digested product;B-1/C-1/D-1:vector plasmid;B-2,3/C-2，3/D-2，3:digested product.圖4 表達(dá)載體酶切驗(yàn)證Figure 4 Expression vector digested verification

2.4 農(nóng)桿菌工程菌的制備及鑒定

將表達(dá)載體pC-NTLA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404感受態(tài)細(xì)胞.提取質(zhì)粒并用引物P1/P2、C1/E2和A1/A2進(jìn)行PCR鑒定，目標(biāo)條帶大小與預(yù)期一致，證明目標(biāo)載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌.

2.5 甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化再生苗的獲得

用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)3個(gè)甘藍(lán)型油菜品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化(圖5)，經(jīng)草甘膦篩選，共獲得了共45株再生苗(‘1831R’ 20株；‘新疆21109’14株；‘隴上東’11株).提取再生植株的葉片DNA，以E1/E2引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，其中共有5株(‘1831R’2株；‘新疆21109’2株；‘隴上東’1株)能得到大小分別約為1 300 bp的特異片段，野生型植株則未出現(xiàn)(圖6)，說明外源基因已重組到轉(zhuǎn)化植株的DNA中.

2.6 轉(zhuǎn)基因植株靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

2.6.1 轉(zhuǎn)基因植株EPSPS基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 在轉(zhuǎn)化植株中(圖7)，與對(duì)照(CK)相比，EPSPS基因的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異，其相對(duì)表達(dá)量均呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，在不同的株系中，上調(diào)水平有所不同，在‘1831R’中，EPSPS基因的表達(dá)水平分別為對(duì)照的2.0和2.1倍左右.‘隴上東’中，EPSPS基因的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的1.9倍左右.‘新疆21109’中，EPSPS基因的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的2.1和2.2倍左右.由此說明，外源EPSPS基因已經(jīng)在轉(zhuǎn)化植株中成功表達(dá).

A：預(yù)培養(yǎng)；B：農(nóng)桿菌侵染及共培養(yǎng)；C：誘導(dǎo)的愈傷組織及草甘膦篩選；D：分化芽；E：生根誘導(dǎo).A：pre-cultivation；B：agrobacterium infection and co-culture；C：induced callus and glyphosate screening；D：shoot regeneration；E：rootage induction.圖5 甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化過程Figure 5 Genetic transformation of Brassica napus

M：DNA Marker；1、2、3、4、5、6、7：轉(zhuǎn)基因陽性植株DNA的PCR檢測(cè)(EPSPS基因)；8：非轉(zhuǎn)基因植株DNA的PCR檢測(cè)；9：陽性對(duì)照(質(zhì)粒pTOPO-EPSPS)；10：空白對(duì)照(水).M:DNA Marker;1,2,3,4,5,6,7:PCR detection of transgenic positive plant DNA (EPSPS gene);8:PCR detection of non-transgenic plant DNA;9:positive control (plasmid pTOPO-EPSPS);10:Blank control (water).圖6 轉(zhuǎn)基因陽性植株的PCR鑒定Figure 6 PCR identification of transgenic positive plants

2.6.2 轉(zhuǎn)基因植株phyA基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 在轉(zhuǎn)化植株中(圖8)，與對(duì)照(CK)相比，phyA基因的相對(duì)表達(dá)量均呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，在不同的株系中，上調(diào)水平有所不同，在‘1831R’中，phyA基因的表達(dá)水平分別為對(duì)照的1.67和1.49倍左右.‘隴上東’中，phyA基因的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的1.76倍左右.‘新疆21109’中，phyA基因的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的1.69和1.75倍左右.由此說明，外源phyA基因已經(jīng)在轉(zhuǎn)化植株中成功表達(dá).

*代表差異顯著或極顯著(*P<0.05、**P<0.01或***P<0.001).Asterisks indicate significent difference or extreme significent difference(*P<0.05、**P<0.01或***P<0.001)，Error bars indicate SD of three biological replicates eachwith three technical replicates.圖7 EPSPS基因在甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因株系中的相對(duì)表達(dá)量Figure 7 Relative expression of EPSPS gene in transgenic strains of Brassica napus L.

*代表差異顯著或極顯著(*P<0.05、**P<0.01或***P<0.001).Asterisks indicate significent difference or extreme significent difference(*P<0.05、**P<0.01或***P<0.001)，Error bars indicate SD of three biological replicates eachwith three technical replicates.圖8 phyA基因在甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因株系中的相對(duì)表達(dá)量Figure 8 Relative expression of phyA gene in transgenic strains of Brassica napus L.

3 討論

Klein等[14]在研究擬南芥和矮牽?；‥PSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽時(shí)發(fā)現(xiàn)，它們都能將異源的EPSPS蛋白定位到葉綠體中.隨著基因工程技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn)，現(xiàn)在已經(jīng)可以將葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽與抗草甘膦的EPSPS基因融合，使其在植物中表達(dá)草甘膦抗性[15].鑒于轉(zhuǎn)運(yùn)肽對(duì)EPSP合成酶前體進(jìn)入葉綠體至關(guān)重要，所以本試驗(yàn)運(yùn)用生物學(xué)信息軟件分析并克隆了油菜葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽eCTP，使之與來自CP4菌株的EPSPS基因融合，構(gòu)建了含有融合基因的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，以期獲得草甘膦抗性基因超表達(dá)的甘藍(lán)型油菜品種.而qRT-PCR結(jié)果顯示，EPSPS基因均在陽性植株中表達(dá)并較CK顯著上調(diào)了1.9～2.2倍.但是轉(zhuǎn)基因植株對(duì)草甘膦濃度的適應(yīng)能力還需在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)陽性植株是否具有較高的草甘膦抗性.

為了提高作物對(duì)土壤中有機(jī)態(tài)磷的吸收利用，促進(jìn)磷素資源的可持續(xù)利用，本試驗(yàn)構(gòu)建了由植物PHT1磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的AtPht1;2啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)植酸酶基因表達(dá)的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法來轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株.qRT-PCR結(jié)果顯示，陽性植株與對(duì)照(CK)相比，phyA基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)了1.49～1.76倍.初步證明phyA基因已在轉(zhuǎn)基因陽性植株中表達(dá)，Richardson等[16]構(gòu)建了由根毛特異性啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)融合有信號(hào)肽的黑曲霉植酸酶基因phyA的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中植酸酶會(huì)在信號(hào)肽的引導(dǎo)下被分泌到根外.在僅有植酸鹽為磷源的條件下，植株分泌的植酸酶會(huì)分解植酸鹽，釋放無機(jī)態(tài)磷(Pi)，供植株吸收利用.方小平等[17]將植酸酶基因轉(zhuǎn)入油菜品種‘中雙6號(hào)’中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株能有效表達(dá)植酸酶基因，并且其能以植酸為唯一磷源正常生長，而非轉(zhuǎn)基因植株則不能.前人這些研究都與本試驗(yàn)結(jié)果一致，但由于植酸酶活性受溫度、土壤pH等外界因素影響較大，仍需通過后續(xù)檢驗(yàn)以確定植酸酶對(duì)于作物磷素高效吸收利用的影響.

本試驗(yàn)中存在一定的不足之處，主要體現(xiàn)在假陽性較高和轉(zhuǎn)化效率較低兩方面，這導(dǎo)致后續(xù)試驗(yàn)不能如期進(jìn)行.油菜轉(zhuǎn)基因過程中，篩選劑的濃度至關(guān)重要，它影響著油菓轉(zhuǎn)化效率，過高的篩選劑濃度得不到足夠的轉(zhuǎn)化體個(gè)數(shù)，過低的篩選劑濃度會(huì)產(chǎn)生大量假陽性植株而起不到應(yīng)有的篩選效果，后期工作量很大[18].本試驗(yàn)假陽性較高可能是由于篩選劑(草甘膦)濃度較低或者篩選時(shí)間較短引起.后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以通過增加篩選劑濃度或延長篩選時(shí)間來降低假陽性高的問題.關(guān)于轉(zhuǎn)化效率低的問題，回顧試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)問題可能存在于預(yù)培養(yǎng)及侵染液濃度和侵染時(shí)間.關(guān)于預(yù)培養(yǎng)的問題，許本波等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型黃籽油菜下胚軸的再生頻率，受預(yù)培養(yǎng)激素濃度的影響較大，下胚軸在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)之前先進(jìn)行一段時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，有利于提高分化效率，預(yù)培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2,4-D.而本試驗(yàn)所用預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D，這可能影響到下胚軸的分化效率.王景雪等[20]也認(rèn)為同一品種，在不同的激素組合培養(yǎng)基上，油菜下胚軸分化頻率會(huì)有很大差異.農(nóng)桿菌的侵染濃度以及時(shí)間對(duì)于轉(zhuǎn)化過程也是十分重要的，劉品等[21]在‘中油821’外植體分化研究中發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌濃度D600=0.4時(shí)，侵染5 min的外植體分化率最高.而本試驗(yàn)采用的農(nóng)桿菌工程菌濃度D600=0.5，侵染時(shí)間為10 min，這可能導(dǎo)致外植體愈傷效率下降，影響最終的轉(zhuǎn)化率.后續(xù)試驗(yàn)中為達(dá)到高轉(zhuǎn)化率，需進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，篩選出適應(yīng)于本試驗(yàn)的高效轉(zhuǎn)化體系.

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過構(gòu)建雙價(jià)基因表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，使其同時(shí)具有草甘膦抗性和高效磷素吸收利用的能力，為今后培育磷高效吸收利用兼具有草甘膦抗性的優(yōu)良甘藍(lán)型油菜新品種奠定基礎(chǔ).