袁佳秋 田 野 洑香香

(南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,南京林業(yè)大學林學院,南京 210037)

楊樹為楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)樹種的統(tǒng)稱，是栽培利用價值極高的主要造林樹種之一[1]。其中以美洲黑楊(Populusdeltides)和歐美楊(P.×euramericana)為主的黑楊派是中緯度平原地區(qū)重要的人工造林樹種，目前通過引進和雜交育種獲得了大量的無性系后代。早在20世紀70、80年代，I-69楊、I-63楊和I-72楊等多個美洲黑楊和歐美楊無性系就已經(jīng)成為我國江淮平原及長江中下游地區(qū)推廣的主栽無性系，并以此雜交出NL-95楊、NL-895楊等速生優(yōu)良無性系，促進了我國楊樹產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展[2～3]。黑楊派的早期選育側(cè)重無性系的前期生長速度，推廣的品種以雌性為主。近年來，由于雌株飄絮所造成的不利影響，新選育的雄性無性系(NL-3804楊、NL-3412楊等)有逐漸替代原有無性系用于造林的趨勢。但這些親緣關(guān)系相近的無性系極為相似，很難從形態(tài)學、細胞學或生理學等方面對其進行辨別，這也在一定程度上影響了推廣栽培過程中適宜無性系的使用。因此，尋找快速有效的方法對不同無性系進行鑒別，將會為優(yōu)良無性系的推廣應(yīng)用和規(guī)范市場提供依據(jù)。

自20世紀90年代以來，分子標記技術(shù)的發(fā)展為生物種質(zhì)鑒定提供了新的技術(shù)平臺，標記手段包括基于雜交的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和基于PCR擴增的隨機擴增多態(tài)性(RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、簡單重復序列(SSR)、簡單重復序列區(qū)間擴增多態(tài)性(ISSR)等[4]。這些分子標記已被廣泛應(yīng)用于楊樹的種質(zhì)鑒定；其中，因SSR標記具有多態(tài)性豐富、重復性好、穩(wěn)定性高等特點，在楊樹種內(nèi)、種間的鑒定分析研究中應(yīng)用最廣泛[5～7]。根據(jù)開發(fā)標記的來源不同，SSR標記可分為基因組-SSR(gSSR)、轉(zhuǎn)錄組SSR和EST-SSR[8]。與gSSR標記相比，EST-SSR標記具有開發(fā)簡單、成本低廉等特點，而且EST序列的保守程度較高，使該標記具有較好的通用性；并且隨著公共數(shù)據(jù)中EST序列量的不斷擴大，為其開發(fā)和應(yīng)用提供了更好的平臺[9]。目前，EST-SSR標記在親緣關(guān)系相近的物種間比較作圖、遺傳圖譜的構(gòu)建、品種鑒定及雜種鑒定等方面具有較高的利用開發(fā)的價值[10～11]。

本研究針對江淮流域南方型黑楊主栽區(qū)無性系使用混亂且無法有效鑒別的問題，選擇自引進以來先后重點推廣栽植的12個無性系為材料，基于楊樹EST序列開發(fā)SSR標記，通過構(gòu)建其指紋圖譜進行無性系鑒定；同時，基于EST-SSR標記位點，對12個無性系的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進行了分析和評價，為主栽區(qū)優(yōu)良無性系的有效保護和推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為12個黑楊無性系(表1)，主要包括我國20世紀70年代起引入的美洲黑楊和歐美楊無性系及后期通過雜交育種選育并在江淮流域重點推廣種植的無性系，且目前材料從外觀形態(tài)上均具有美洲黑楊的特征。于2017年6月，在南京林業(yè)大學楊樹種質(zhì)資源圃中采集當年生扦插苗的嫩葉，于-70℃冷凍保存、備用。

1.2 DNA提取與檢測

采用試劑盒(TIANGEN-DP350，中國)、CTAB法[12]和SDS法[13]等3種方法提取總DNA，重復3次，無菌水溶解后測定核酸濃度(NanoDrop 2000c，美國)，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選最優(yōu)方法提取的DNA樣品，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR分析

EST序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫，采用EST-trimmer軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對楊樹EST序列進行分析，用MISA軟件找出SSR標記后再利用primer 3在線設(shè)計從而獲得EST-SSR標記。共30對EST-SSR引物，由擎科生物公司合成。

以4個無性系的基因組DNA作為模板，對所有引物進行初篩。20 μL PCR反應(yīng)體系包括：2×Taq MasterMix(Takara公司)10 μL，引物各0.25 mol·μ-1，模板DNA 25 ng，ddH2O補足。在ProFlexTMBasePCR擴增儀上進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序[14]：94℃預變性5 min；94℃變性40 s；35個循環(huán)包括退火溫度55℃，復性30 s，72℃延伸40 s；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行有效性檢測，隨后采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳[15]檢測PCR產(chǎn)物，進行多態(tài)性引物篩選。若為多態(tài)性引物，則重復3次，來驗證擴增產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

1.4 指紋圖譜建立及數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.1軟件中Duncan’s新復極差法對不同DNA提取方法下的DNA濃度進行多重比較。電泳結(jié)果采用基因型系統(tǒng)記錄譜帶位置。根據(jù)電泳條帶大小，用A、B、C…按條帶長度從大到小對條帶進行判讀和編號，從而建立數(shù)據(jù)矩陣。利用最少的引物對對12種無性系進行區(qū)分，找出不同無性系的特征條帶用于鑒定，并繪制指紋圖譜。利用Popgene 32軟件[16]進行數(shù)據(jù)處理，分析遺傳多樣性參數(shù)，并利用DPS 7.5軟件[17]進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取方法的優(yōu)化

研究表明，試劑盒法、CTAB法和SDS法提取的DNA濃度分別為150.63～266.70 ng·μL-1(平均為206.31 ng·μL-1)、2 134.13～3 032.36 ng·μL-1(平均為3 032.36 ng·μL-1)和3 410.13～9 364.70 ng·μL-1(4 962.87 ng·μL-1)，后兩種方法DNA得率均顯著高于試劑盒法，多重比較表明3種提取方法間DNA得率存在顯著差異(P<0.05)；同時，3種方法提取的DNA OD260/280均在1.8～2.0，表明DNA純度均較好。CTAB法較SDS法條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，RNA降解完全。綜合比較，CTAB法更適合用于本研究SSR分析。

2.2 多態(tài)性分析

通過初篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1對引物沒有擴增產(chǎn)物，4對引物產(chǎn)生的片段大小遠大于預期大小。進一步多態(tài)性檢驗，共獲得18對多態(tài)性引物，并擴增出88條條帶，且擴增產(chǎn)物穩(wěn)定，重復性好。進一步發(fā)現(xiàn)多態(tài)性條帶為62條，多態(tài)性比率為70.5%(表2)；引物擴增條帶數(shù)在1～12條，平均每個引物擴增4.89條，擴增片段長度為75～625 bp。

2.3 指紋圖譜構(gòu)建及無性系鑒定

通過擴增，獲得了一些樣品特異性位點，如丹紅楊特異性位點EU43-560、I-35楊特異性位點EU11-200等，共5個樣本獲得7個特異譜帶；其它樣本則可通過引物組合進行鑒別(圖1)。通過綜合分析，最少可以利用EU147、EU43、EU11、EU164和EU-81共5對引物構(gòu)建12個黑楊無性系的EST-SSR指紋圖譜(表3)。在該指紋圖譜中，每個無性系均可應(yīng)用特有位點或位點組合加以鑒定(表4)。

表2 18對EST-SSR引物信息及其擴增結(jié)果

圖1 5對引物在12個南方型黑楊主栽無性系間的擴增圖譜 A.引物EU81；B.引物147；C.引物EU11和EU43；D.引物EU164；M. Markers(DL2000)Fig.1 Amplification profiles of 12 southern-type poplar clones with 5 pairs of primers A. Primer EU81; B. Primer 147; C. Primer EU11 and EU43; D. Primer EU164; M. Markers(DL2000)

EST-SSR位點EST-SSR loci條帶大小Band size(bp)無性系編號Code of clones123456789101112EU43575————560—540——520——————————484—————EU147250—200—151——————————138————————————EU11281——250——————241——231—————————213—————————200—175———156————138—————120———100————————————80——EU164231—175————————————EU81536————————————500—

表4 基于EST-SSR分子標記的無性系鑒定檢索表

表5 EST-SSR擴增位點的遺傳參數(shù)分析

表6 基于EST-SSR標記計算的12個南方型黑楊無性系遺傳相似性和遺傳距離

注：右上角.無性系間遺傳相似性值；左下角.遺傳距離(cM)

Note:Above “****”. Genetic similarity value between different clones; Below “****”. Genetic distance(cM)

圖2 基于EST-SSR標記12個南方型黑楊主栽無性系的聚類圖Fig.2 Dendrogram of clustering from 12 southern-type poplar clones with EST-SSR

2.4 遺傳多樣性分析

2.5 黑楊主栽無性系的親緣關(guān)系分析

SSR標記檢測到的遺傳相似系數(shù)為0.602 0～0.904 0(表6)，其中NL-895楊與I-69楊的遺傳相似系數(shù)最大(0.904 0)，親緣關(guān)系較近，遺傳差異較??；而I-63楊和NL-3804楊的遺傳相似系數(shù)最小(0.602 0)，遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠。根據(jù)樹狀聚類圖，在遺傳距離為0.40處，可將12個無性系劃分為2大類：NL-3804單獨聚為一類，其它無性系聚為另一類。其中，NL-95楊、NL-895楊和I-69楊聚為一小類，這與其相似的親本遺傳信息相吻合；楚林2號和I-72聚為一類，這與兩者均具有歐美楊的遺傳背景相關(guān)(圖2)?？傮w而言，各無性系間的遺傳距離均較為接近，與其均具有相似的黑楊遺傳背景有關(guān)。

3 討論

3.1 SSR標記擴增產(chǎn)物帶型分析

EST-SSR引物的擴增產(chǎn)物一般分為兩種情況：一是理想產(chǎn)物與預期產(chǎn)物長度相符合的特異片段；二是長于預期擴增片段的非特異性片段[18]。本研究中發(fā)現(xiàn)有大約1/5引物的擴增產(chǎn)物與預期目標產(chǎn)物大小有差別，一方面可能是受EST序列的內(nèi)含子影響，引物本身的特異性不強[19]；另一方面可能是以基因組DNA(含有內(nèi)含子)為模板進行擴增的過程中，這些內(nèi)含子被擴增出來，其產(chǎn)生的多態(tài)是內(nèi)含子長度多態(tài)，而不是簡單重復序列產(chǎn)生的長度多態(tài)[20]。在后續(xù)的研究中，需要分析引物對應(yīng)的EST序列，確定EST序列中是否含有內(nèi)含子，以進一步確保標記開發(fā)的有效性。

3.2 EST-SSR標記多態(tài)性分析

多態(tài)性是評價分子標記的重要依據(jù)。一般認為，EST來自表達基因的編碼序列，具有高度保守性，與gSSR標記相比多態(tài)性較低[21]。楊新泉等[22]利用這兩類SSR標記對我國北方冬麥區(qū)的18份普通小麥(TriticumasetivumL.)品種的遺傳多樣性進行探討，發(fā)現(xiàn)平均每個gSSR檢測到的等位基因數(shù)(3.34)明顯高于EST-SSR(2.31)；宋躍朋等[23]對16個楊樹無性系進行遺傳差異分析的結(jié)果也表明EST-SSR平均檢測到的等位基因數(shù)(2.8)要低于gSSR所檢測到的(4.1)。本研究利用EST-SSR檢測到的黑楊的平均等位基因數(shù)(2.15)與以上研究結(jié)果相近。此外，與其他分子標記的多態(tài)性相比，本研究中EST-SSR標記的多態(tài)性高于ISSR[24]，但低于SRAP[13]和AFLP[25]。由此可見，本研究中EST-SSR標記的多態(tài)性整體較低可能還與試驗材料本身遺傳差異較小有很大關(guān)系，與其他研究中多為派間或種間的材料所體現(xiàn)的高多態(tài)性有明顯區(qū)別，并且這種差異在梨屬(Pyrusspp.)研究中也得到證實[26]。

3.3 無性系鑒定效率評價

一般認為，標記的鑒定效率與標記的多態(tài)性有關(guān)，而多態(tài)性則可以反映出檢測到的基因型數(shù)量情況，其數(shù)量越多說明該標記具有較高的鑒別能力[27]。在利用SSR標記進行品種鑒定時，參試標記的多態(tài)性越高，其鑒定效率往往也越高[28～29]。本研究通過5對引物可將供試材料完全鑒別(表2)，鑒定效率和馮錦霞等[30]的研究相近，與兩個研究所用的材料遺傳背景均相近、多態(tài)性偏低有關(guān)。此外，張亞東等[31]需要利用4對EST-SSR引物，其引物多態(tài)率為70.5%，對8個親緣關(guān)系較近的黑楊品種進行鑒別；劉春英[32]需要利用3對SSR引物，其引物多態(tài)率為58.3%，建立5個楊樹無性系的DNA指紋圖譜。進一步說明了種質(zhì)鑒定效率高低與其多態(tài)性高低有關(guān)，但在根本上則是受到供試材料親緣關(guān)系遠近的影響。由此可見，對于親緣關(guān)系較近的無性系，需要更多的引物來進行分析鑒定以確保品系的優(yōu)良性[33]。

本研究篩選出18對多態(tài)性引物對12個無性系的DNA進行擴增，利用5對引物可將江淮流域主栽的黑楊無性系加以鑒別，表明EST-SSR標記可以作為無性系鑒定的有效手段。將來隨著大量楊樹EST序列的公布，直接利用EST序列來開發(fā)SSR標記將更加簡便而且準確，基于EST-SSR標記進行無性系分子鑒定的手段也必將成為無性系鑒定技術(shù)發(fā)展的一個趨勢。