葉衛(wèi)軍 陳圣男 楊 勇 張麗亞 田東豐 張 磊 周 斌

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綠豆SSR標(biāo)記的開發(fā)及遺傳多樣性分析

葉衛(wèi)軍**陳圣男**楊 勇 張麗亞 田東豐 張 磊 周 斌*

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 安徽合肥 230031

SSR標(biāo)記以其數(shù)量豐富、多態(tài)性好、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)在基礎(chǔ)研究和育種工作中發(fā)揮了重要作用, 但目前綠豆基因組中的SSR標(biāo)記依然較少。本研究將磁珠富集法和測(cè)序技術(shù)相結(jié)合高通量檢測(cè)綠豆基因組SSR位點(diǎn), 鑒定出3,275,355個(gè)SSR位點(diǎn), 開發(fā)了2742個(gè)SSR標(biāo)記。選取其中157個(gè)SSR進(jìn)行PCR驗(yàn)證, 發(fā)現(xiàn)有90個(gè)(57.33%)標(biāo)記在10份材料中表現(xiàn)出多態(tài)性。挑選40個(gè)條帶清晰、多態(tài)性高、染色體上均勻分布的標(biāo)記對(duì)90份綠豆資源進(jìn)行遺傳多樣性分析, 單個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位變異數(shù)為2~8個(gè), 平均為3.0個(gè), 有效等位基因數(shù)為1.31~4.21個(gè), 平均為2.16。Nei’s基因多樣性指數(shù)在0.23~0.76之間, 平均為0.51。多態(tài)性信息含量為0.22~0.72, 平均為0.43。聚類分析將90份材料分為2個(gè)類群, 包含4個(gè)組。第I組主要由北方資源組成, 第II組種質(zhì)來源較為分散, 第III組主要由山東的資源構(gòu)成, 第IV組包含多數(shù)河北的種質(zhì)資源。本研究開發(fā)的多態(tài)性SSR標(biāo)記不僅可以用于綠豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析, 也將在高密度遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標(biāo)記輔助育種中發(fā)揮重要作用。

綠豆; 測(cè)序; SSR; 引物設(shè)計(jì); 遺傳多樣性

綠豆([L.] Wilczek), 別名青小豆、菉豆、植豆, 是豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionaceae)菜豆族(Phaseoleae)豇豆屬()的1個(gè)栽培種, 染色體數(shù)2= 2= 22。綠豆是喜溫作物, 起源于中國, 已有2000多年的種植歷史[1]。但也有證據(jù)表明綠豆原產(chǎn)于印度, 約在3500年前被馴化[2]。目前, 綠豆主要在溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)種植, 年種植面積600萬公頃[3]。綠豆屬高蛋白、中淀粉、低脂肪類食物, 富含多種礦質(zhì)元素、維生素和活性物質(zhì), 具有抗菌、抗腫瘤、降血壓和解毒作用, 一直作為藥食同源作物[4]。綠豆適應(yīng)性廣, 生育期短, 抗逆性強(qiáng), 并具有共生固氮、改良土壤的能力, 可與玉米、棉花、薯類等作物間套種, 提高經(jīng)濟(jì)效益[5-6]。但長(zhǎng)期以來, 綠豆一直被視作小雜糧, 基礎(chǔ)研究水平遠(yuǎn)落后于水稻、小麥和玉米等大宗作物。Kang等[7]2014年通過測(cè)序技術(shù)得到大小為431 Mb的綠豆基因組草圖, 為綠豆遺傳育種和功能基因組學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

SSR (simple sequence repeat)標(biāo)記因其共顯性、多態(tài)性高、易操作、耗費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn), 在綠豆遺傳多樣性分析[8-9]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[10-11]和QTL定位[12]等方面的應(yīng)用越來越廣泛。而且有研究報(bào)道SSR標(biāo)記在豇豆屬作物中也有一定的通用性[13-14]。由于綠豆分子標(biāo)記的研究起步較晚, 現(xiàn)已發(fā)布的SSR標(biāo)記數(shù)量有限[15-21]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 富集文庫和高通量測(cè)序成為目前常用的SSR位點(diǎn)的鑒定方法。Wang等[22]通過構(gòu)建SSR-富集文庫的方法開發(fā)了6100個(gè)SSR標(biāo)記, 發(fā)現(xiàn)只有9.10%的引物在野生資源和栽培種中表現(xiàn)出多態(tài)性。選取的1700對(duì)引物中僅有49對(duì)(2.88%)在32份綠豆資源中表現(xiàn)出多態(tài)性, 說明這些引物的多態(tài)性水平較低。Chen等[23]利用高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了13,134個(gè)EST-SSR位點(diǎn), 對(duì)其中200個(gè)位點(diǎn)的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn), 有66個(gè)(33.00%)標(biāo)記在31份資源中表現(xiàn)出多態(tài)性。Liu等[24]利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 鑒定出3788個(gè)EST-SSR位點(diǎn), 其中320個(gè)位點(diǎn)中有53個(gè)(16.56%)在4份栽培品種中表現(xiàn)出多態(tài)性。由于這些研究利用的是單個(gè)品種的序列信息, 引物在多份種質(zhì)中的多態(tài)性結(jié)果無法分析, 標(biāo)記開發(fā)后需大量的引物驗(yàn)證工作, 且多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量較少, 嚴(yán)重限制了SSR標(biāo)記的使用效率。本研究利用磁珠富集和高通量測(cè)序相結(jié)合的方法高效獲取多個(gè)品種的重復(fù)序列片段信息, 通過序列聚類和SSR位點(diǎn)長(zhǎng)度多態(tài)性分析進(jìn)行SSR引物的設(shè)計(jì), 提高了標(biāo)記開發(fā)的效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究材料為本單位從全國各地收集、整理、保存的90份綠豆資源(表1), 包括北京12份、安徽12份、河南4份、江蘇11份、吉林6份、河北17份、湖北2份、內(nèi)蒙古1份、遼寧2份、黑龍江1份、山西12份、山東8份、重慶2份。選取中綠5號(hào)、蘇綠2號(hào)、皖科綠3號(hào)、濰綠11號(hào)、濰綠12號(hào)等10份地理來源不同且表型差異較大的綠豆品種用于SSR引物的開發(fā)及多態(tài)性驗(yàn)證。

1.2 基因組文庫構(gòu)建與探針設(shè)計(jì)

采用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取DNA, 將測(cè)序所用的10個(gè)DNA樣本等質(zhì)量混合后隨機(jī)片段化構(gòu)建DNA文庫, 文庫的插入片段大小控制在400 bp左右。SSR富集所采用的探針包括p(AG)10、p(AC)10、p(AAC)8、p(ACG)8、p(AAG)8、p(AGG)8、p(ACAT)6和p(ATCT)68種。具體操作步驟參考孫子奎等[25]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)獲取、整理與SSR位點(diǎn)發(fā)掘

利用Illumina MiSeq2000平臺(tái)測(cè)序, 測(cè)序模式為Paired-end (雙端)。測(cè)序完成后, 采用Adapter Removal V2.1.7[26]去除接頭污染, 并刪除測(cè)序質(zhì)量較差和較短的序列。利用FLASH V1.2.11[27]軟件對(duì)雙端測(cè)序的序列進(jìn)行整合。用微衛(wèi)星識(shí)別工具(Microsatellite identification tool, MISA, http://pgrc. ipkgatersleben.de/misa/)從所有序列中查找SSR位點(diǎn)。SSR位點(diǎn)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重復(fù)次數(shù)最少為10、6、5、5、5和5次。

1.4 序列聚類及SSR多態(tài)性評(píng)估

采用Perl程序屏蔽序列上的重復(fù)序列, 過濾掉側(cè)翼序列短于20 bp的短序列, 并利用cdhit軟件對(duì)過濾后的核苷酸序列進(jìn)行聚類, 聚類所采用的核苷酸序列相似度設(shè)置為95%。若一條序列上有2個(gè)及以上SSR的序列則分開統(tǒng)計(jì)聚類群組。用Perl程序解析聚類結(jié)果, 根據(jù)SSR的長(zhǎng)度分別統(tǒng)計(jì)每一類, 若同一類中所有SSR的長(zhǎng)度一致, 則該類的多態(tài)性為1; 如果同一類中SSR具有2種長(zhǎng)度, 則該類的多態(tài)性為2; 依此類推, 獲得每一類SSR長(zhǎng)度的多態(tài)性數(shù)據(jù)。

1.5 引物設(shè)計(jì)與篩選

用Primer3 V2.3.6[28]對(duì)群組內(nèi)多態(tài)性≥2的SSR序列的兩端設(shè)計(jì)引物。選取SSR類型為非單核苷酸重復(fù)單元、非復(fù)合重復(fù)單元且每條序列上只有1個(gè)SSR的序列設(shè)計(jì)引物。引物的物理位置和大小參考綠豆基因組序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome/664)。篩選后的引物用PCR驗(yàn)證多態(tài)性, 反應(yīng)體系包含50 ng μL-1基因組DNA 1 μL、正反向引物(10 μmol L-1)各0.5 μL、2×PCR Master Mix (TIANGEN) 5.0 μL, 補(bǔ)水至10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s,m(根據(jù)引物設(shè)定) 30 s, 72℃延伸2 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min, 12℃保存。將PCR產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺電泳, 銀染后讀帶。

表1 供試綠豆材料信息

1.6 遺傳多樣性分析

按照各SSR位點(diǎn)PCR擴(kuò)增片段遷移率的不同分別讀取數(shù)據(jù), 并依據(jù)分析軟件的要求相應(yīng)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)格式。用POPGENE V1.32[29]軟件計(jì)算等位基因數(shù)(allele number, Na)和有效等位基因數(shù)(effective number of allele, Ne)。用PowerMarker V3.25軟件[30]計(jì)算標(biāo)記多態(tài)性信息含量(polymorphism information content, PIC)和Nei’s基因多樣性(Nei’s gene diversity, H)?；贜ei’s遺傳距離并采用UPGMA (unweight pair group method using arithmetic averages, 非加權(quán)平均數(shù))法對(duì)供試綠豆資源進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)整理

采用雙末端測(cè)序的方法對(duì)SSR富集文庫進(jìn)行測(cè)序, 共得到原始測(cè)序序列11,105,850條, 包含3,253,148,219 bp。過濾數(shù)據(jù), 去除接頭污染和低質(zhì)量的測(cè)序序列得到高質(zhì)量的序列10,413,002條, 占原始測(cè)序序列總數(shù)的93.76%, 包含2,474,490,321 bp, 占測(cè)序總堿基數(shù)的76.06%。過濾后的數(shù)據(jù)Q20 (堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基所占百分比)和Q30 (堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基所占百分比)分別為98.54%和92.99%, 表明該文庫的測(cè)序質(zhì)量較好, 可滿足后續(xù)分析的需求。

2.2 SSR搜索與多態(tài)性評(píng)估

采用FLASH V1.2.11對(duì)過濾后序列的R1端和R2端進(jìn)行整合。可以合并的序列數(shù)為4,577,639對(duì), 占總數(shù)(5,206,501)的87.92%, 合并后序列總長(zhǎng)度為1,582,586,848 bp。用SSR識(shí)別工具在所有整合后的序列中搜索SSR位點(diǎn), 共得到3,275,355個(gè)SSR位點(diǎn), 頻率為71.55%, 平均每0.48 kb一個(gè)SSR位點(diǎn)。這些SSR位點(diǎn)分布在1,146,445條序列中, 其中有705,057條(61.50%)序列包含1個(gè)以上SSR, 以復(fù)合形式存在的SSR數(shù)量為2,077,761個(gè)(63.44%)。對(duì)這些位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn), 單、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)單元的數(shù)量分別有337,267、343,776、2,580,413、8624、3429和1846個(gè), 分別占總數(shù)的10.30%、10.50%、78.78%、0.26%、0.10%和0.06% (圖1-A)。三核苷酸重復(fù)單元中AAC/GTT類型有2,341,675個(gè), 占該類型的90.75% (圖1-D), 而CCG/CGG型出現(xiàn)頻率最低, 只有60個(gè)。單核苷酸重復(fù)單元中, A/T類型的重復(fù)序列出現(xiàn)頻率最多, 占該類型的98.94%, G/C類型僅有3584個(gè), 占1.06% (圖1-B)。二核苷酸重復(fù)單元有4種類型, AC/GT類型有209,412個(gè), 占60.84%, 為主導(dǎo)地位, 其次為AT/AT和AG/CT型, 最少的為CG/CG型, 只有75個(gè)(圖1-C)。四核苷酸重復(fù)單元出現(xiàn)22種類型, 其中ACAT/ATGT和AAAT/ATTT出現(xiàn)頻率較高, 分別為45.55%和29.20%, 其他幾種重復(fù)類型的出現(xiàn)頻率均低于0.1% (圖1-E)。五核苷酸重復(fù)類型共有36種, 其中AAAAT/ATTTT和AAATC/ATTTG出現(xiàn)頻率較高, 分別為47.94%和29.54% (圖1-F)。六核苷酸重復(fù)類型有74種, 出現(xiàn)頻率較高的為AACAAG/CTTGTT和AAGAGG/CCTCTT, 占比29.14%和11.65% (圖1-G)。

2.3 SSR引物設(shè)計(jì)

對(duì)含有SSR位點(diǎn)的序列進(jìn)行過濾, 側(cè)翼序列長(zhǎng)度超過20 bp的共有661,715條。對(duì)過濾后的序列按序列相似度進(jìn)行聚類, 發(fā)現(xiàn)這些序列分布在534,209個(gè)類群中。根據(jù)SSR的長(zhǎng)度分別對(duì)每一類統(tǒng)計(jì)分析, 有92.15%的SSR位點(diǎn)在選取的10份材料中不表現(xiàn)出長(zhǎng)度多態(tài)性, 剩余的SSR多數(shù)長(zhǎng)度多態(tài)性為2, 表現(xiàn)出高多態(tài)性的SSR只占較少比例(表2)。利用引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)SSR長(zhǎng)度多態(tài)性≥2的序列兩端設(shè)計(jì)引物, 得到2742對(duì)引物。

2.4 SSR引物篩選與多態(tài)性分析

對(duì)設(shè)計(jì)的引物按SSR長(zhǎng)度多態(tài)性高、染色體上均勻分布等原則進(jìn)行篩選后, 選取157對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證。有90對(duì)引物可擴(kuò)增出多態(tài)性片段, 占比57.33% (表3), 其余有15對(duì)引物表現(xiàn)出非特異性擴(kuò)增或無擴(kuò)增產(chǎn)物、52對(duì)引物可擴(kuò)增出目的條帶但無多態(tài)性(圖2-A)。同時(shí)發(fā)現(xiàn), 各染色體上的多態(tài)性引物比率差異較大, 第1、第3、第4染色體上的多態(tài)性引物比率較高, 分別有10、9和7個(gè), 占比均超過了70%, 而第9染色體上的引物多態(tài)性比率最低, 只有4個(gè), 只占29.57% (圖2-B)。

圖1 SSR的類型和頻率分布

A: 不同類型SSR的分布頻率, Momo-、Di-、Tri-、Tetra-、Penta-、Hexa-分別代表單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù); B~G: 單核苷酸(B)、二核苷酸(C)、三核苷酸(D)、四核苷酸(E)、五核苷酸(F)和六核苷酸(G)的重復(fù)類型及頻率。

A: frequency of different SSR types. Momo-, Di-, Tri-, Tetra-, Penta-, and Hexa-represents mononucleotide, dinucleotide, trinucleotide, tetranucleotide, pentanucleotide and hexanucleotiede repeat motif, respectively. B-G: Mon-(B), Di-(C), Tri-(D), Tetra-(E), Penta-(F), and Hexa-(G) motif types and frequency.

2.5 SSR引物特征分析

從90對(duì)引物中選取40對(duì)條帶清晰且多態(tài)性較高的引物對(duì)90份綠豆資源進(jìn)行遺傳多樣性分析, 引物信息見表4?？梢钥闯? 單個(gè)引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)在2~8個(gè), 平均為3個(gè), 等位基因數(shù)最高的為Vr11-4, 有8個(gè)。有效等位基因數(shù)為1.31~4.21個(gè), 平均為2.16個(gè)。Nei’s基因多樣性指數(shù)在0.23 (Vr8-4)~ 0.76 (Vr3-2)之間, 平均為0.51。引物多態(tài)性信息含量在0.22~0.72之間, 平均為0.43。PIC小于0.25的低多態(tài)性引物僅有1個(gè)(Vr8-4), PIC大于0.5高多態(tài)性位點(diǎn)有13個(gè), 占比32.5%。

2.6 綠豆種質(zhì)資源的聚類分析

基于UPGMA聚類分析, 90份材料可分為A、B兩個(gè)大類群, 包含I、II、III、IV 4個(gè)組(圖3)。第I組包含21份種質(zhì), 分別來源于安徽(5份)、北京(2份)、河北(2份)、吉林(4份)、遼寧(1份)、內(nèi)蒙古(1份)、山西(6份), 除安徽種質(zhì)外, 其余為東北和華北資源。第II組包含22份種質(zhì), 分別來源于安徽(3份)、江蘇(6份)、山東(1份)、北京(6份)、黑龍江(1份)、吉林(1份)、湖北(1份)、山西(3份), 種質(zhì)地理分布較為分散。第III組包含10份種質(zhì), 分別來源于河南(1份)、山東(7份)、北京(1份)和遼寧(1份), 主要為山東種質(zhì)。第IV組包含31份種質(zhì), 分別來源于安徽(2份)、北京(2份)、重慶(2份)、江蘇(5份)、河南(3份)、河北(14份)和山西(3份), 河北種質(zhì)主要聚類在該組。可見具有相同地理來源的材料多數(shù)可以聚在一起或成簇狀分布, 表明來源相同的種質(zhì)具有較近的親緣關(guān)系。

表2 SSR長(zhǎng)度多態(tài)性評(píng)估

A: 157對(duì)引物PCR結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析; B: 11條染色體上的引物擴(kuò)增情況。MSP表示多態(tài)性擴(kuò)增的標(biāo)記, MSN表示可擴(kuò)增出目的條帶但無多態(tài)性的標(biāo)記, MNN表示非特異性擴(kuò)增或無擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記。

A: statistical analysis of PCR amplification results of the 157 primers; B: primer amplification results on the 11 chromosomes. MSP: markers amplified specific and polymorphic bands; MSN: markers amplified specific and non-polymorphic bands; MNN: markers amplified non-specific or no bands.

表4 40對(duì)SSR引物的信息

(續(xù)表4)

引物名稱Name等位基因數(shù)Allele number有效等位基因數(shù)Effective number of allele多態(tài)性信息含量Polymorphism information contentNei’s基因多樣性Nei’s gene diversity Vr7-2021.720.330.41 Vr7-2521.750.340.43 Vr8-332.130.420.53 Vr8-431.310.220.23 Vr8-1432.540.520.60 Vr9-321.800.350.45 Vr9-1442.210.510.55 Vr10-752.780.580.64 Vr10-943.290.640.69 Vr10-1731.470.300.34 Vr11-483.250.640.69 Vr11-932.080.430.51 Vr11-1031.510.300.35 平均Mean32.160.430.51

圖3 根據(jù)Nei’s遺傳距離的綠豆資源UPGMA聚類圖

1~90為表1中供試綠豆編號(hào)。

1-90 correspond with the number of mung bean accessions given in Table 1.

3 討論

目前, 開發(fā)SSR標(biāo)記的方法有很多種。傳統(tǒng)的磁珠富集法優(yōu)勢(shì)在于可高效獲得具有重復(fù)序列的片段, 但需要挑選陽性克隆測(cè)序后才能設(shè)計(jì)引物, 費(fèi)時(shí)費(fèi)力, 且多態(tài)性引物比率不高。吳傳書[31]利用磁珠富集法開發(fā)6100對(duì)綠豆SSR引物, 只有559對(duì)在24份綠豆材料中表現(xiàn)出多態(tài)性, 多態(tài)率僅為9.16%。采用生物信息學(xué)技術(shù)開發(fā)SSR標(biāo)記也是目前常用的方法, 其優(yōu)點(diǎn)在于可以獲取大量的序列信息, 便于高通量操作。但該方法需要對(duì)基因組或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后才能進(jìn)行SSR位點(diǎn)的檢索, 比較適用于基因組序列信息較豐富的物種。且這種方法獲取的數(shù)據(jù)多為單個(gè)品種的序列信息, 無法對(duì)SSR位點(diǎn)在多份資源中的多態(tài)性進(jìn)行評(píng)估, 引物的多態(tài)率也較低, 尤其不適用于綠豆等遺傳多樣性較低的物種。本研究將磁珠富集法和測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來, 高通量獲得多個(gè)品種的重復(fù)序列片段序列信息, 平均每0.48 kb就有1個(gè)SSR位點(diǎn), 高于Tangphatsornruang等[20]鑒定的1/67 kb的頻率和Gupta等[32]發(fā)現(xiàn)的1/3.4 kb的頻率。在鑒定的SSR中, 以復(fù)合形式存在的SSR占據(jù)較高的比例(63.44%)。Wang等[22]也發(fā)現(xiàn)綠豆基因組中有43.10%的SSR以復(fù)合形式存在, 但從綠豆EST序列中發(fā)現(xiàn)的復(fù)合SSR占比卻非常低[23,32], 這表明復(fù)合SSR可能多數(shù)存在于非編碼區(qū)。在所有的SSR位點(diǎn)中, 三核苷酸重復(fù)單元為主導(dǎo)類型, 與Gupta等[32]和Wang等[22]的結(jié)果一致, 但與Tangphatsornruang等[20]和Chen等[23]的結(jié)果有偏離。其次為二核苷酸和單核苷酸重復(fù), 而四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)只占總數(shù)的0.42%。在三核苷酸重復(fù)單元中, AAC/GTT型占該類型的比例高達(dá)90.75%, 與Wang等[22]結(jié)果一致, 且與蠶豆中的SSR鑒定結(jié)果類似[33]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)C/G (CG/CG或CCG/CGG)型SSR位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率均較低, 這在前人研究中也有報(bào)道。Wang等[22]鑒定的單核苷酸重復(fù)類型中A/T占比為88.30%, Chen等[23]和Liu等[24]發(fā)現(xiàn)A/T型占單核苷酸重復(fù)的比例高達(dá)99.70%和95.71%, 且Liu等[24]在二核苷酸重復(fù)單元中也僅發(fā)現(xiàn)2個(gè)CG/GC位點(diǎn)。在其他作物如大豆[34]和小麥[35]中也發(fā)現(xiàn)有類似情況。這可能由于富含C/G的序列主要存在于基因組的編碼區(qū), 也可能與綠豆基因組具有較低的GC含量(34.30%)有關(guān)。

通過對(duì)多個(gè)品種的相似序列聚類后, 將SSR位點(diǎn)在各品種中的長(zhǎng)度進(jìn)行多態(tài)性分析。發(fā)現(xiàn)92.15%的SSR長(zhǎng)度多態(tài)性為1, 這與綠豆栽培資源遺傳變異水平較低有關(guān), 也揭示了前人研究報(bào)道中綠豆多態(tài)性SSR標(biāo)記比率較低的原因。采用引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)長(zhǎng)度多態(tài)性≥2的位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)引物, 既獲得豐富的引物信息, 也提高了多態(tài)性引物的比率, 引物驗(yàn)證結(jié)果表明多態(tài)性引物占總數(shù)的57.33%, 遠(yuǎn)高于Wang等[22]和Chen等[23]的研究結(jié)果, 但低于Gupta等[32]的結(jié)果。理論上通過這種方法設(shè)計(jì)的引物應(yīng)全部表現(xiàn)出多態(tài)性, 但由于測(cè)序技術(shù)和引物設(shè)計(jì)水平的限制, 部分引物不具有多態(tài)性, 在以后的研究中應(yīng)努力改善。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)多態(tài)性引物在綠豆基因組上表現(xiàn)為不均勻分布, 部分染色體區(qū)域上的多態(tài)性引物較少, 這可能與引物所在的基因組位置(如端粒、著絲粒、基因組保守區(qū)域)有關(guān), 在以后的引物篩選中應(yīng)加強(qiáng)這部分染色體區(qū)域的引物設(shè)計(jì)。

SSR標(biāo)記作為分子標(biāo)記的一種, 可在DNA水平上揭示材料的遺傳變異, 且不受植株發(fā)育時(shí)期和地理?xiàng)l件限制, 具有其他形態(tài)學(xué)標(biāo)記或生理生化標(biāo)記不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。利用分子標(biāo)記研究綠豆資源遺傳多樣性已有多篇報(bào)道, 但通常是隨機(jī)選擇一些多態(tài)性引物, 引物在染色體上分布可能不均勻, 不能從基因組整體水平上反應(yīng)資源的遺傳變異[8-9]。本研究挑選40對(duì)條帶清晰、多態(tài)性較好且在染色體上均勻分布的引物對(duì)綠豆資源進(jìn)行遺傳多樣性分析, 能夠從基因組整體水平上揭示資源的遺傳變異, 結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。引物檢測(cè)到的等位變異數(shù)在2~8個(gè), 平均為3個(gè), 與王麗俠等[13]和劉巖等[8]的研究結(jié)果基本一致。引物PIC值在0.22~0.72之間, 平均為0.43, 高于前人的研究結(jié)果[8-9,13], 表明選取的引物適用于資源遺傳多樣性分析。聚類結(jié)果顯示相同地理來源的材料多數(shù)可以聚在一起, 表明來源相同的種質(zhì)具有較近的親緣關(guān)系, 但也揭示了該地區(qū)綠豆資源遺傳基礎(chǔ)較為狹窄, 在以后的育種工作中應(yīng)加強(qiáng)外來種質(zhì)的引進(jìn)和使用, 提高品種的遺傳多樣性。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)部分種質(zhì)沒有嚴(yán)格按照地理來源聚類, 尤其是來源于北京的中綠系列和來源于江蘇的蘇綠系列的種質(zhì)在聚類圖上分布較為分散。這可能與所用引物及材料的數(shù)量和來源有關(guān), 也可能是因?yàn)檫@部分綠豆資源作為親本在國內(nèi)各地區(qū)間頻繁交換使用。本研究所用種質(zhì)多來源于東北、華北、華東等綠豆主產(chǎn)區(qū), 南方綠豆資源數(shù)量不夠豐富, 因此不能全面體現(xiàn)國內(nèi)綠豆種質(zhì)的遺傳變異水平, 在以后的研究工作中應(yīng)加強(qiáng)南方綠豆資源的收集和遺傳多樣性分析。

4 結(jié)論

以磁珠富集法結(jié)合測(cè)序技術(shù)高通量檢測(cè)綠豆SSR位點(diǎn), 共鑒定出3,275,355個(gè)SSR位點(diǎn), 設(shè)計(jì)了2742個(gè)標(biāo)記。選取157個(gè)引物驗(yàn)證發(fā)現(xiàn), 有57.33%的引物在10份材料中表現(xiàn)出多態(tài)性, 多態(tài)性引物比率較高。聚類分析將90份材料分為2個(gè)大類群, 包含4個(gè)組。地理來源較近的資源多數(shù)可被聚在一起或成簇狀分布, 表明種質(zhì)地理來源與其親緣關(guān)系的一致性。本研究開發(fā)的分子標(biāo)記適用于綠豆遺傳連鎖圖譜和指紋圖譜的構(gòu)建、基因挖掘和遺傳多樣性分析等工作。種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的結(jié)果也為綠豆起源與進(jìn)化、核心種質(zhì)庫的構(gòu)建、優(yōu)異種質(zhì)資源的保護(hù)和提高優(yōu)良材料的利用率奠定基礎(chǔ)。

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Development of SSR markers and genetic diversity analysis in mung bean

YE Wei-Jun**, CHEN Sheng-Nan**, YANG Yong, ZHANG Li-Ya, TIAN Dong-Feng, ZHANG Lei, and ZHOU Bin*

Crop Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, Anhui, China

SSR markers play an important role in basic research and crop breeding due to their advantages of large number, high polymorphism and co-dominant inheritance. However, there are still few SSR markers available in mung bean. In this study, the magnetic bead enrichment method and sequencing technology were combined to identify the SSR loci of mung bean in high throughput, a total of 3,275,355 SSR loci were found, and 2742 markers were developed. A total of 157 markers were selected for validation by PCR method, 90 (57.33%) showed polymorphic among 10 mung bean accessions. Forty SSR markers with clear PCR products, high polymorphism and uniform distribution on chromosomes were selected to evaluate the genetic diversity among 90 mung bean accessions. The number of alleles per marker varied from two to eight, with an average of three. The effective number of alleles ranged from 1.31 to 4.21, with a mean value of 2.16. The Nei’s gene diversity was between 0.23 and 0.76, with an average of 0.51. Polymorphism information content was between 0.22 and 0.72, with a mean of 0.43. Cluster analysis distributed 90 materials into two clusters, including four groups. The germplasm of group II came from several areas, while those of groups I and III were mainly from North China and Shandong province, respectively. Most of the gerplasm from Hebei pro-vince were clustered in Group IV. These polymorphic SSR markers will be valuable for genetic diversity analysis, high-resolution genetic linkage maps construction, gene mapping and marker assisted selection in mung bean breeding.

mung bean; sequencing; SSR; primer design; genetic diversity

2018-11-21;

2019-01-19;

2019-03-16.

10.3724/SP.J.1006.2019.84155

周斌, E-mail:18756019871@139.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

葉衛(wèi)軍, E-mail: 963472965@163.com; 陳圣男, E-mail: chensn1226@163.com

本研究由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研項(xiàng)目(18T0206), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-08-Z11)和國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFE0203800)資助。

This study was supported by the Research Program of Anhui Academy of Agricultural Sciences (18T0206), the China Agriculture Research System (CARS-08-Z11), and the National Key Research and Development Program (2016YFE0203800).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190314.1427.008.html