劉國躍，王 勇，陳 淼

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學科二病區(qū)，貴州 遵義 563099)

重癥加強治療病房(Intensive Care Unit，ICU)是各類危重患者救治的地方，尤其是呼吸衰竭后行機械通氣的患者，而此類患者常常需要高濃度氧療，以維持足夠的氧供，但長時間高濃度氧療可對患者肺臟有一定的損傷，即高氧性急性肺損傷(Hyperoxia induced acute lung injury，HALI)，這嚴重影響了患者預后并增加了患者的住院時間及住院費用[1-2]，但目前尚未找到更好的方法或藥物來治療或預防HALI，而尋找一種治療或預防HALI的方法或藥物成為當前的首要任務。本研究擬通過過表達大鼠肺內miRNA-21-5p，研究其對大鼠HALI形態(tài)學改變的影響，為HALI的基因治療尋找理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠96只，雌雄不拘，體重200 g左右，由重慶陸軍軍醫(yī)大學動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.2 miR-21-5p最佳滴度確定 分別取1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106TU /mL 6種不同滴度慢病毒液200 μL ，通過鼻腔滴入大鼠肺內；滴入后0、24、48、72h處死大鼠并觀察大鼠肺組織大體變化及熒光顯微鏡觀察大鼠肺組織內熒光變化情況。

1.3 實驗動物分組及處理 按隨機數(shù)字表法將96只大鼠分為正常組、HALI組和miR-21-5p組3組，每組32只。對照組直接飼養(yǎng)于空氣中；HALI組飼養(yǎng)于高氧箱(氧濃度90%以上，溫度保持在25～27 ℃，濕度保持在50%～70%，CO2濃度<0.5%)中制備HALI模型[3]；miR-21-5p組通過滴鼻法滴入200 μL帶有miR-21-5p的慢病毒液，再飼養(yǎng)于高氧箱中。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準，并經(jīng)遵義醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批。

1.4 檢測指標及方法 每組大鼠分別在實驗開始后0 、24、48、72 h隨機抽取8只大鼠進行指標檢測。

1.4.1 miR-21-5p在肺組織內分布情況 通過滴鼻法滴入帶有miR-21-5p的慢病毒液，使大鼠肺組織內miR-21-5p高表達，通過熒光顯微鏡觀察HALI大鼠肺組織內熒光分布情況。

1.4.2 氧合指數(shù)(OI)和呼吸指數(shù)(RI)測定 于相應時間點抽取大鼠動脈血進行血氣分析，計算OI和RI。OI= PaO2/FiO2，式中，PaO2為動脈氧分壓，F(xiàn)iO2為吸入氧濃度，本實驗中FiO2均記為0.90；RI=P(A-a)O2/PaO2，式中，P(A-a)O2為肺泡-動脈血氧分壓差。

1.4.3 肺組織病理學觀察及病理評分 頸動脈放血處死大鼠，快速取右肺組織進行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變；另外，每張病理切片隨機選擇3個高倍鏡視野(×200)，參照改良評分標準進行病理評分[4]，取平均值。

1.4.4 肺組織濕/干重(W/D)比值測定 頸動脈放血處死大鼠取左肺，去除周圍結蹄組織，并使用濾紙快速擦干組織表面水分，快速稱量，記為肺濕重(W)；再將該肺組織放置在80 ℃干燥箱中恒溫烘烤48 h，取出后再次稱量，直到重量恒定，記為肺干重(D)；根據(jù)以上數(shù)據(jù)計算肺W/D比值。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡下觀察miR-21-5p分布 頸動脈放血處死各種滴度(1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106TU /mL)慢病毒轉染的大鼠，肉眼見肺組織大體變化不明顯，均表現(xiàn)為顏色分布均勻，略呈粉紅色，組織柔軟，未見出血點及組織腫脹。熒光顯微鏡下見：肺組織結構完整，無肺泡壁斷裂，間隔無增寬，無炎性細胞浸潤；隨著轉染滴度的增加，熒光密度逐漸增加；當隨著轉染滴度的增加，熒光分布密度不再增加時濃度記為最佳轉染滴度。反復試驗得出6×106TU /mL為最終實驗轉染滴度。圖1為滴度6×106TU/mL慢病毒轉染各時間點的熒光圖片：轉染后0 h肺組織中熒光分布無或較少；轉染24 h熒光分布開始出現(xiàn)在肺泡，分布較多且均勻；轉染48 h及72 h肺泡內仍可見均勻分布的熒光顆粒。

滴度：(6×106 TU /mL)；綠色熒光代表miR-21-5p的慢病毒(×200)；A：轉染后0h肺組織結構完整，間隔無增寬，無炎性細胞浸潤，綠色熒光分布較少，氣管附近偶見綠色熒光；B：轉染24 h肺組織結構完整，間隔無增寬，無炎性細胞浸潤，可見大量綠色熒光分布，且分布較均勻；C：轉染48 h肺組織結構完整，間隔無增寬，無炎性細胞浸潤，仍可見大量綠色熒光，且分布較均勻；D：轉染72 h肺組織結構完整，間隔無增寬，無炎性細胞浸潤，肺組織內仍可見綠色熒光，且分布較均勻。 圖1 慢病毒液滴入后各時間點大鼠肺組織中miR-21-5p的分布情況

2.2 呼吸參數(shù)變化

2.2.1 OI變化 實驗開始時各組大鼠OI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著時間的延長，正常組大鼠OI無明顯變化(P>0.05)；HALI組大鼠OI逐漸降低(P<0.05)；miR-21-5p組大鼠24 h內OI較實驗開始時明顯降低(P<0.05)，但24 h后變化不大(P>0.05)。HALI組在高氧損傷24、48、72 h OI均明顯低于正常組(P均<0.05)；而miR-21-5p組各時間點OI均高于HALI組(P均<0.05，見表1)。

2.2.2 RI變化 實驗開始時各組大鼠RI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著時間的延長，正常組大鼠RI無明顯變化(P>0.05)；HALI組大鼠RI逐漸升高(P<0.05)；miR-21-5p組大鼠24 h內RI較實驗開始時明顯升高(P<0.05)，但24 h后變化不大(P>0.05)。HALI組在高氧損傷24、48、72 h RI明顯高于正常組(P均<0.05)；而miR-21-5p組各時間點RI均低于HALI模型組(P均<0.05，見表1)。

組別動物數(shù)(只)OI(mmHg)0 h24 h48 h72 h0 h正常32449.83±30.22435.42±28.95460.02±18.56439.25±25.89HALI32450.95±30.54306.19±37.23ad268.52±25.24abd203.81±43.40abcdmiRNA21-5p32444.76±30.30358.10±29.25ad336.67±29.27ad323.81±19.05ad 續(xù)表組別動物數(shù)(只)RI0 h24 h48 h72 h正常320.24±0.050.24±0.040.26±0.030.25±0.0HALI320.25±0.040.31±0.06ad0.38±0.06abd0.46±0.07abcdmiRNA21-5p320.25±0.050.30±0.05ad0.31±0.07ad0.29±0.04ad

miR-21-5p為微小RNA-21-5p，HALI為高氧性急性肺損傷，OI為氧合指數(shù)，RI為呼吸指數(shù)；1 mmHg=0.133kPa；a：與本組0h比較，P<0.05；b：與本組24 h比較，P<0.05；c：與本組48 h比較，P<0.05；d：與正常組比較，P<0.05；e：與HALI組比較，P<0.05。

2.3 肺組織病理學改變及病理評分 光鏡下觀察，各組大鼠實驗開始時肺組織肺泡結構清晰，肺泡間隔無滲出及水腫，間隔無明顯增寬，肺泡腔內未見明顯滲出物，隨時間延長，正常組肺組織無明顯病理改變。HALI模型組損傷24 h肺組織結構仍較清晰，肺泡間隔稍有水腫、增寬，有少量炎性細胞浸潤；48、72 h肺組織結構紊亂，出現(xiàn)肺泡壁斷裂破壞，肺泡腔塌陷，融合成肺大泡，肺泡間隔明顯水腫、增寬，肺泡毛細血管擴張，大量炎性細胞浸潤，肺泡腔內出現(xiàn)水腫液及炎性細胞，可見少量紅細胞；肺組織病理評分隨時間延長逐漸升高，各時間點肺組織病理評分均明顯高于正常組(P均<0.05)。miR-21-5p組肺損傷較HALI組明顯減輕；各時間點肺組織病理評分均低于HALI組(P均<0.05，見圖2、表2)。

A：高氧損傷0 h，3組大鼠肺組織肺泡結構清晰；B：高氧損傷24 h：3組大鼠肺組織結構較清晰，肺泡間隔稍有水腫、增寬，有少量炎性細胞浸潤； C：高氧損傷48 h：正常組大鼠肺組織結構較清晰，HALI組以及miR-21-5p組大鼠肺組織結構紊亂，出現(xiàn)肺泡壁斷裂破壞，炎性細胞浸潤，肺泡腔內出現(xiàn)水腫液及炎性細胞，可見紅細胞，但miR21-5p組較HALI組損傷明顯減輕； D：高氧損傷72 h：正常組大鼠肺組織結構仍清晰，HALI組肺組織結構均明顯紊亂，肺泡壁明顯斷裂破壞，肺泡腔塌陷，肺泡毛細血管擴張，肺泡間隔及肺泡腔大量炎性細胞浸潤，可見紅細胞滲出，miR21-5p組肺泡損傷程度明顯較HALI組輕；HE染色 200×。 圖2 光鏡下觀察各組大鼠各時間點肺組織病理學改變

組別 動物數(shù)(只)0 h24 h48 h72 h正常 32 0.00±0.000.00±0.360.01±0.100.00±0.54HALI320.21±0.410.92±0.72ad3.13±1.38abd5.00±1.48abcdmiRNA21-5p 320.11±0.420.80±0.52ad1.32±0.92ad1.45±0.89ad

miR-21-5p為微小RNA-21-5p，HALI為高氧性急性肺損傷；a：與本組0 h比較，P<0.05；b：與本組24 h比較，P<0.05；c：與本組48 h比較，P<0.05；d：與正常組比較，P<0.05；e：與HALI組比較，P<0.05。

2.4 肺W/D比值變化 實驗開始時各組大鼠肺W/D比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨時間延長，正常組和miR-21-5p組肺W/D比值無明顯變化(P均>0.05)，而HALI組肺W/D比值逐漸增加(P<0.05)。高氧損傷24、48、72 h，HALI組肺W/D比值均明顯高于正常組，而 miR-21-5p組肺W/D比值則明顯低于HALI組(P均<0.05，見表3)。

組別 動物數(shù)(只)0 h24 h48 h72 h正常323.82±0.623.65±0.433.72±0.543.83±0.62HALI323.80±0.654.16±0.42ad4.66±0.35abd5.33±0.26abcdmiRNA-21-5p323.79±0.453.78±0.36e3.95±0.32e3.88±0.30e

miR-21-5p為微小RNA-21-5p，HALI為高氧性急性肺損傷，肺W/D比值為肺濕/干重比值；a：與本組0h比較，P<0.05；b：與本組24 h比較，P<0.05；c：與本組48 h比較，P<0.05；d：與正常組比較，P<0.05；e：與HALI組比較，P<0.05。

3 討論

近年研究顯示，F(xiàn)iO2大于0.90超過24 h即可導致HALI，其主要病理表現(xiàn)為：肺組織結構紊亂，出現(xiàn)肺泡壁斷裂破壞，肺泡腔塌陷，融合成肺大泡，肺泡間隔明顯水腫、增寬，肺泡毛細血管擴張，大量炎性細胞浸潤，肺泡腔內出現(xiàn)水腫液及炎性細胞等[3-5]。HALI的發(fā)病機制目前并不是很清楚，近年研究主要集中在氧化-抗氧化系統(tǒng)和致炎-抗炎系統(tǒng)兩方面；在正常條件下，上述兩系統(tǒng)均處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，以保障機體正常生理功能；但當機體長期暴露在高氧環(huán)境時，上述兩種系統(tǒng)均會被打破，處于失衡狀態(tài)，最終導致HALI[6-7]；如果這一失衡不及時糾正，將會形成惡性循環(huán)，進一步加重HALI[8]。進一步研究顯示，HALI發(fā)生的本質是肺泡上皮細胞的凋亡，并且肺泡上皮細胞的凋亡貫穿于HALI的整個過程，抑制其凋亡，可以明顯減輕HALI[9-10]。

有研究顯示，F(xiàn)iO2較低或是短時間內吸入較高濃度的氧對肺組織無形態(tài)學破壞或破壞較小，但是隨著時間的延長，肺部可產(chǎn)生大量氧自由基，后者可促進肺部炎性因子和趨化因子的分泌，并在肺組織聚集，最終導致肺組織的炎癥性病理改變[11-12]。OI是監(jiān)測呼吸功能的重要指標，在臨床上有助于診斷急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，并且OI的高低與肺部疾病嚴重程度有關[13]。 RI是臨床上用于判斷機體肺的通氣、換氣功能的一個簡單而實用的重要指標，受通氣/血流比值、肺彌散功能及通氣狀況的影響，但不受呼吸方式和FiO2的影響，故較PaO2的結果更可信，并且與OI呈明顯的負相關[14]；RI能較客觀地評價ARDS的病情變化，對治療ARDS具有重要的指導意義[15]。

miRNA是一類新近發(fā)現(xiàn)的含有18-22個核苷酸的非編碼小分子RNA，廣泛表達于機體的各個組織和器官，在機體的病理生理過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用；通過RNA干擾機制在轉錄后水平負性調控約30%的人類基因，并且這些基因參與了細胞生長發(fā)育到細胞凋亡的整個生命過程[16-17]。miR-21屬于miRNA家族，位于染色體17q23.2上，是具有自主轉錄單位的miRNA，它具有獨立的啟動子，其表達不受其它基因啟動子的調控[18]，這與共用一個啟動子的miRNA不同，并且miR-21的啟動子具有多個增強子結合位點，如信號傳到與轉錄激活因子3(STAT3)、水通道蛋白-1(AP-1)等，它們通過不同的信號通路來共同介導miR-21的表達，后者是一種抗凋亡基因，目前在腫瘤相關研究中最多，并且研究顯示miR-21在大多數(shù)腫瘤中高表達[19]。另有研究報道，miR-21可通過下調Bax/Bcl-2比值、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)及程序性細胞死亡因子4(PDCD4)的表達抑制人腦膠質瘤U87MG細胞[20]、胃癌細胞[21]、神經(jīng)細胞[22]等多種細胞凋亡。

本課題組前期通過過氧化氫建立肺泡上皮細胞的凋亡模型，利用基因芯片技術篩選肺泡上皮細胞凋亡的相關基因，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p高表達，并明確miR-21-5p可能是肺泡上皮細胞的重要抗凋亡基因[23]；進一步研究顯示，miR-21-5p可能是通過下調Bax、caspase-3蛋白和上調Bcl-2蛋白表達而發(fā)揮抗凋亡作用的[24]。本研究顯示，高氧吸入24 h后大鼠OI逐漸下降，RI、肺W/D比值及肺病理評分逐漸升高，肺組織結構的病理破壞程度也同時增加；但當轉染miR-21-5p后發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p組OI明顯高于模型組，而RI、肺W/D比值及肺病理評分明顯低于模型組。由此說明，miR-21-5p過表達能有效減輕HALI的程度，對大鼠肺形態(tài)學有顯著影響，但具體機制仍不清楚，尚需進一步研究。