周 祺，袁 康，劉 芳，都立輝,*

（1.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023 ；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014 ）

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是一種重要的條件致病菌，人體的多個器官、系統(tǒng)包括皮膚軟組織、泌尿道、呼吸系統(tǒng)等都可能由其引發(fā)細菌感染性疾??；其可通過氣管以及有創(chuàng)傷的皮膚表面等多個途徑傳播。陰溝腸桿菌對營養(yǎng)的要求較低，其廣泛存在于動物腸道中，由其引起的食物中毒事件也時有發(fā)生[1-3]。近年來，隨著抗生素等抗菌藥物的頻繁使用，陰溝腸桿菌的耐藥性問題也得到了越來越多的關(guān)注[4-5]。鑒于食品中豐富的營養(yǎng)環(huán)境，陰溝腸桿菌可在多種食品中繁殖。這不僅導(dǎo)致了食品的腐敗變質(zhì)，還造成了相應(yīng)食品的安全隱患，經(jīng)傳統(tǒng)熱殺菌和普通化學(xué)殺菌制備的食品中常能檢出這類細菌的存在。因此，控制陰溝腸桿菌的生長、減少由其引起的食物中毒事件是食品相關(guān)工作者的目標。

香芹酚又名2-甲基-5-異丙基苯酚，分子式為C10H14O，是牛至和百里香等植物精油的主要成分[6]。香芹酚易溶于乙醇，幾乎不溶于水。在日常生活中，香芹酚可用于制作香料、食品添加劑、驅(qū)蟲劑、衛(wèi)生殺菌劑、防腐劑等。近年來，香芹酚的抑菌性也受到了廣泛的關(guān)注[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚對微生物、螨蟲等均具有抑制作用[10-11]。前期有研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚對細菌、霉菌等的細胞形態(tài)均存在破壞作用，同時能夠影響細胞的完整性與功能性[12]。所以，推測香芹酚在破壞細胞膜的完整性方面起著重要的作用。本實驗旨在研究香芹酚對陰溝腸桿菌細胞的殺菌效果和作用機制，通過檢測香芹酚處理后陰溝腸桿菌細胞胞外ATP化學(xué)發(fā)光值，利用激光共聚焦顯微鏡觀察香芹酚處理對細菌細胞膜通透性的影響，并采用掃描電子顯微鏡觀察香芹酚對細菌細胞形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香芹酚（純度99%） 湖北鑫潤德化工有限公司；陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae C4） 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；BHI培養(yǎng)基 北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PI 生工生物工程股份有限公司；DiSC3(5)、5(6)-cFDA美國Sigma公司；ATP檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；THZ-C臺式恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦顯微鏡 美國鉑金埃爾默公司；掃描電子顯微鏡德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

陰溝腸桿菌接種于BHI液體培養(yǎng)基中，生長至對數(shù)期時將菌液與滅菌后質(zhì)量分數(shù)40%甘油以體積比1∶1混合后保存在-80 ℃冰箱中備用?；罨瘯r將凍存的菌液解凍后以體積分數(shù)1%接種于BHI培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)12 h。

1.3.2 香芹酚對陰溝腸桿菌的最小抑菌濃度的測定

將生長至對數(shù)期（OD600nm＝0.6）的陰溝腸桿菌以體積分數(shù)1%接種于一定體積的BHI液體培養(yǎng)基中備用，將香芹酚溶于體積分數(shù)60%乙醇中得到初含量為16 μL/mL的香芹酚溶液。把配制好的菌液按體積比1∶1加入二倍稀釋后的香芹酚溶液中，得到香芹酚終含量分別為2、1、0.5、0.25、0.125 μL/mL的體系，以配制好的菌液加水作為空白對照組，置于30 ℃下培養(yǎng)10 h，檢測各處理組在不同時間的OD600nm[13]，以O(shè)D600nm無明顯變化的最低香芹酚含量為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.3 香芹酚抑菌活性的檢測

將陰溝腸桿菌菌液按體積分數(shù)1%接種于BHI液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期備用。取10 mL菌液，離心收集菌泥，加入相同體積的含量分別為0（空白對照組）、0.25、0.5、1、2 μL/mL的香芹酚溶液，將菌懸液放入搖床中，分別在0、30、60、90、120、180 min時取樣，用滅菌生理鹽水按照10 倍體積梯度稀釋[14]。每個樣品取100 μL均勻地涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)48 h后對菌落計數(shù)。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察香芹酚處理對陰溝腸桿菌細胞形態(tài)的影響

將生長至對數(shù)期的陰溝腸桿菌以體積分數(shù)1%接種于培養(yǎng)基中，加入香芹酚至終含量為0.125 μL/mL，將混合液置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，觀察香芹酚在培養(yǎng)過程中對菌體形態(tài)的影響。取生長到對數(shù)期的菌液8 mL于滅菌離心管中，6 000 r/min離心8～10 min得到菌泥，分別加入含量為1 μL/mL和2 μL/mL的香芹酚，以加入相同體積滅菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為空白對照組，置于30 ℃處理1 h。以5 500 r/min離心10 min，在4 ℃下使用質(zhì)量分數(shù)2.5%戊二醛固定過夜，2 500 r/min、4 ℃離心5 min。加入超純水放置10 min，離心，重復(fù)3次；用體積分數(shù)遞增（分別為50%、70%、80%、90%、100%）的乙醇各脫水1 次，將樣品固定在鏡片上，噴金、拍照[15-16]。

1.3.5 胞外ATP化學(xué)發(fā)光值測定

將生長至對數(shù)期的陰溝腸桿菌菌液以6 000 r/min離心8～10 min，使用pH 7.4 PBS洗滌兩次，分別將菌泥懸浮在0（對照組）、0.25、0.5、1、2 μL/mL香芹酚溶液中，30 ℃下培養(yǎng)，分別在0、10、30、60、120、180 min時取樣。樣品在4 ℃、12 000 r/min離心1 min，取上清液，加入ATP檢測試劑，混合均勻后按試劑盒說明書測其化學(xué)發(fā)光值[17]。

1.3.6 細胞膜內(nèi)外電勢的測定

將5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸與5 mmol/L葡萄糖混合配制緩沖液A，將培養(yǎng)至對數(shù)期的陰溝腸桿菌4 ℃、6 000 r/min離心10 min，將菌泥用緩沖液A重懸2 次并離心。將菌泥重懸于含2 mmol/L乙二胺四乙酸的緩沖液A體系中。向樣品中加入熒光探針DiSC3(5)至終濃度為0.5 μmol/L，室溫下放置10～15 min。每個樣品取200 μL，加入1 μmol/L尼日利亞菌素作為陰性對照，加入10 μmol/L纈氨霉素作為陽性對照，并設(shè)置菌懸液為空白對照組，以加入香芹酚溶液至終含量分別為0.25、0.5、1、2 μL/mL作為處理組。使用酶標儀檢測其熒光強度，激發(fā)波長為622 nm，發(fā)射波長為670 nm[18-19]。

1.3.7 細胞膜滲透性觀察

使用熒光探針5(6)-cFDA和PI檢測細胞膜的受損情況[23]。將培養(yǎng)至對數(shù)期的陰溝腸桿菌菌液以6 000 r/min離心10 min，向菌泥中加入等體積的PBS作為空白對照組，以加入含量分別為0.25、0.5、1、2 μL/mL香芹酚溶液作為處理組，在30 ℃、200 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)1 h。樣品再次離心后用500 μL PBS懸浮菌泥。向每個樣品中加入熒光探針5(6)-cFDA至終濃度達到2.5 μmol/L，避光反應(yīng)10 min；然后加入10 μL紅色核酸熒光染液PI使其終濃度為0.5 μmol/L，避光反應(yīng)10 min。取2～3 μL菌液轉(zhuǎn)接到載玻片上，加上蓋玻片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察[20-21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗至少重復(fù)3 次，采用Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)并繪制圖表，使用SPSS 22軟件進行多因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 香芹酚對陰溝腸桿菌的MIC

從圖1可以看出，不同含量的香芹酚溶液對陰溝腸桿菌均有一定的抑制效果，當(dāng)香芹酚含量在0.5 μL/mL以上時抑菌效果明顯。因此，推測香芹酚對陰溝腸桿菌的MIC為0.5 μL/mL。隨著香芹酚含量的增加，OD600nm下降，說明香芹酚對陰溝腸桿菌的抑制作用隨含量的增加而增強。

陰溝腸桿菌是革蘭氏陰性菌，可以引發(fā)人體食物中毒以及皮膚、呼吸道、胃腸道和其他器官的感染，因此其治療和耐藥性受到越來越多的關(guān)注。相比于其他抑菌劑[22-23]，較低含量的香芹酚對陰溝腸桿菌有較好的抑制效果。

圖1 不同含量香芹酚對陰溝腸桿菌的生長抑制作用Fig. 1 Effects of different concentrations of carvacrol on the growth of E. cloacae

2.2 不同含量香芹酚對陰溝腸桿菌的殺菌效果

圖2 不同含量香芹酚對陰溝腸桿菌的殺菌效果Fig. 2 Bactericidal effects of different concentrations of carvacrol on E. cloacae

從圖2可以看出，當(dāng)初始菌落數(shù)約為3×108CFU/mL時，0.25、0.5、1、2 μL/mL香芹酚溶液均對陰溝腸桿菌有殺菌作用。即使香芹酚含量為0.25 μL/mL時仍可在一定程度上抑制細菌的生長。香芹酚含量為0.5、1、2 μL/mL時菌落數(shù)快速下降，并在60～180 min內(nèi)完全殺死細菌，與空白對照組相比差異明顯。

2.3 香芹酚對陰溝腸桿菌細胞形態(tài)的影響

圖3 經(jīng)香芹酚處理的陰溝腸桿菌掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig. 3 SEM images of E. cloacae cells treated by carvacrol

由圖3可知，空白對照組（圖3A）細胞圓潤飽滿、形態(tài)完整、表面光滑。0.125 μL/mL處理組（圖3B）部分細胞表面產(chǎn)生孔洞并發(fā)生褶皺，且細胞呈黏連狀態(tài)，推測細菌的細胞膜在生長過程中受到損傷。1 μL/mL（圖3C）和2 μL/mL（圖3D）處理組細胞均出現(xiàn)了嚴重的干癟和變形。可以看出香芹酚對陰溝腸桿菌細胞的完整性有極強地破壞作用，并使細胞生長時的形態(tài)發(fā)生變化。

從圖3可以看出，少量的香芹酚就可以在細胞的生長繁殖階段對其產(chǎn)生影響，使細胞變形，形成孔洞，細胞外壁變得粗糙。隨著香芹酚含量的增加，細胞發(fā)生更加嚴重的變形，1 μL/mL和2 μL/mL香芹酚幾乎能夠溶解菌體。香芹酚破壞了菌體細胞的完整性，并引起細胞膜通透性和菌體形態(tài)的改變。推測香芹酚的抑菌機制可能與其理化特性相關(guān)。香芹酚可能首先作用于細胞膜，導(dǎo)致細胞膜通透性的增加，使細胞內(nèi)ATP等物質(zhì)滲出，影響其生理活性；隨后，香芹酚可能進一步穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)部并與細胞器相互作用，以抑制菌體活性。

2.4 胞外ATP化學(xué)發(fā)光值測定結(jié)果

圖4 香芹酚處理對陰溝腸桿菌胞內(nèi)ATP泄漏的影響Fig. 4 Effect of carvacrol on intracellular ATP leakage from E. cloacae cells

圖4 中空白對照組樣品ATP化學(xué)發(fā)光值初始時為1 819，培養(yǎng)的3 h中無明顯變化。細菌經(jīng)過香芹酚處理后，各處理組的ATP化學(xué)發(fā)光值均高于空白對照組；而經(jīng)過1、2 μL/mL香芹酚處理后，細菌的ATP化學(xué)發(fā)光值變化明顯，尤其是前10 min變化較大。各處理組的ATP化學(xué)發(fā)光值大幅增加，說明香芹酚處理會使陰溝腸桿菌細胞內(nèi)的ATP大量流出。由統(tǒng)計分析結(jié)果可知，香芹酚含量和ATP化學(xué)發(fā)光值之間存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），即陰溝腸桿菌細胞內(nèi)ATP的釋放是由香芹酚的處理造成的。

細胞內(nèi)的ATP是儲存和提供代謝能量以及細胞內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的重要小分子物質(zhì)[24]。本實驗中香芹酚處理增加了陰溝腸桿菌細胞釋放的ATP水平。在0～10 min時，1、2 μL/mL香芹酚處理組的胞外ATP化學(xué)發(fā)光值變化明顯，推測是因為高含量的香芹酚對陰溝腸桿菌有很強的瞬時破壞作用，增加其細胞通透性，使ATP快速流出。隨著細菌細胞膜被破壞，細胞制造ATP的能力降低，因此ATP化學(xué)發(fā)光值也有所下降。而ATP的大量流出也證實了細胞膜的破壞以及胞內(nèi)物質(zhì)的流出，說明香芹酚對陰溝腸桿菌具有抑制作用。

2.5 香芹酚處理對陰溝腸桿菌細胞膜內(nèi)外電勢的影響

圖5 香芹酚處理對陰溝腸桿菌細胞膜內(nèi)外電勢的影響Fig. 5 Effect of carvacrol on the cell membrane potential of E. cloacae

由圖5可知，空白對照組細菌的熒光強度沒有明顯變化，而不同含量香芹酚處理均會引起陰溝腸桿菌細胞膜內(nèi)外電勢的改變。經(jīng)香芹酚處理的樣品在第1次檢測時的結(jié)果即明顯高于空白對照組，這是由于從加入香芹酚到開始測定需要大約1 min，此時香芹酚已經(jīng)開始對陰溝腸桿菌產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致其膜電勢改變。由此可知，香芹酚可以在短時間內(nèi)使陰溝腸桿菌的細胞膜內(nèi)外電勢明顯改變。由統(tǒng)計分析結(jié)果可知，香芹酚含量和細菌細胞膜內(nèi)外的電勢變化之間存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.01）。

細胞受到損傷時，DiSC3(5)探針從細胞膜上釋放，因此能夠檢測到熒光強度增加。細胞膜電勢的變化影響質(zhì)子進出細胞的動力，阻礙細菌細胞產(chǎn)生ATP，影響小分子物質(zhì)在細胞內(nèi)外的交換[25-26]。也有人提出，細胞膜去極化并不是抑菌物質(zhì)發(fā)揮作用的主要方式，但是可以促使抑菌物質(zhì)進入細胞內(nèi)部[27]。

2.6 細胞膜完整性觀察結(jié)果

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察陰溝腸桿菌細胞膜的完整性Fig. 6 Observation of cell membrane integrity by laser scanning confocal microscope

如圖6所示，細胞膜完整的細胞在染色后呈現(xiàn)綠色熒光，PI則進入細胞膜破損的細胞并將其染成紅色。未經(jīng)香芹酚處理的空白對照組（圖6A）細胞樣品染色后主要為綠色熒光，而經(jīng)過0.25、0.5、1 μL/mL和2 μL/mL香芹酚處理1 h后的樣品中紅色熒光隨著香芹酚含量的增加而逐漸增強，說明經(jīng)過香芹酚處理后陰溝腸桿菌細胞膜遭到破壞，通透性有所增加。

經(jīng)過兩種核酸熒光探針5(6)-cFDA和PI染色后，可區(qū)分細胞膜完整的細胞和膜受損細胞。由于PI與細胞內(nèi)物質(zhì)的親和性強于5(6)-cFDA，所以膜受損的細胞在PI進入后導(dǎo)致5(6)-cFDA熒光強度降低?？瞻讓φ战M幾乎均為綠色熒光；而隨著香芹酚含量的增加，紅色熒光的比例逐漸增加，綠色熒光逐漸減少，2 μL/mL香芹酚處理組視野中幾乎均為紅色熒光。這也進一步證明了香芹酚能夠破壞細菌細胞膜，從而進入細胞內(nèi)與胞內(nèi)物質(zhì)作用[28]。

3 結(jié) 論

目前，植物精油的應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注和重視。與其他抑菌劑相比，香芹酚具有無毒、安全性高、抗菌性強等優(yōu)點[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)香芹酚對陰溝腸桿菌有較強的抑制效果。推測香芹酚作用于細胞膜，改變膜電勢，增加細胞膜通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)流出，導(dǎo)致細胞功能喪失，從而使細胞失活。

由香芹酚對陰溝腸桿菌的MIC和殺菌效果可以看出，香芹酚對陰溝腸桿菌的抑菌效果與其含量成正比，不同含量的香芹酚對陰溝腸桿菌均存在抑制作用。經(jīng)香芹酚處理的陰溝腸桿菌菌落數(shù)迅速減少，且與對照組相比差異明顯。同時，香芹酚接觸細胞時，細胞膜內(nèi)外的電勢明顯改變，細胞形態(tài)被嚴重破壞。通過激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)香芹酚處理的陰溝腸桿菌細胞紅色熒光更強，表明其細胞膜的完整性被破壞。因此，香芹酚對陰溝腸桿菌的作用方式主要是通過作用于細菌的細胞膜，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，使細胞膜通透性增加，改變細胞膜內(nèi)外電勢，使ATP等內(nèi)容物從細胞內(nèi)滲出，最終表現(xiàn)出殺菌作用。本實驗研究不同含量的香芹酚對陰溝腸桿菌的殺菌作用和抑菌機理，為香芹酚應(yīng)用于陰溝腸桿菌的控制提供一定的理論參考。