付求來 吳潔 朱先飛

摘? 要：隨著SSR分子標(biāo)記技術(shù)在玉米室內(nèi)測純、一致性及真實(shí)性鑒定等方面的應(yīng)用，該技術(shù)已經(jīng)逐漸成為種子企業(yè)質(zhì)量檢測后控的基本手段。但由于其檢測量大，準(zhǔn)確性要求高的特點(diǎn)，使其對DNA提取質(zhì)量的要求增加。該文以快速DNA提取方法為基礎(chǔ)，在普通的實(shí)驗(yàn)條件下，設(shè)置4種不同沸水浴的堿煮時(shí)間，比較提取DNA后的電泳效果，尋求適合一般種子企業(yè)實(shí)驗(yàn)室SSR分子試驗(yàn)要求的DNA快速提取方法，為種子企業(yè)的快速質(zhì)量測定奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：SSR;DNA快速提取;堿煮時(shí)間

中圖分類號 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0020-3

Abstract：With the use of SSR technology in the aspects of corn chamber test purity，consistency and authenticity identification，this technology has gradually become the seed enterprise quality testing after the control of the basic means.Due to its high detection quantity and high accuracy，the requirement of DNA extraction quality is increased.In this paper，based on the previous human rapid DNA extraction method，under the general experimental conditions of seed enterprises，four different boiling water bath alkali boiling time was set to compare the effect of DNA extraction after electrophoresis，to find a suitable method for rapid DNA extraction in the laboratory of seed enterprises，so as to lay a foundation for rapid quality determination of seed enterprises.

Key words：SSR;Rapid DNA extraction;Alkali boiling time

近些年來，由于分子標(biāo)記技術(shù)具有明顯的多態(tài)性、共顯性、重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于種子的純度、一致性、真實(shí)性檢測、分子標(biāo)記輔助選擇以及轉(zhuǎn)基因檢測等方面，其中SSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用最廣。而在整個(gè)SSR試驗(yàn)過程，從DNA提起到擴(kuò)增再到電泳，DNA提取是整個(gè)技術(shù)過程的前提和關(guān)鍵，如何提取質(zhì)量較好的DNA，將影響到后面擴(kuò)增環(huán)節(jié)，并最終影響到電泳的結(jié)果。前人的研究中，李榮華[1]通過改進(jìn)CTAB法提取高純度DNA;王艷[2]利用試劑盒進(jìn)行DNA快速提取;郭景倫[3-4]的玉米單粒DNA快速提取方法簡單有效，被廣泛應(yīng)用。利用種子胚乳進(jìn)行堿煮，此方法極大地提高了檢測效率，尤其在種子企業(yè)的純度檢測方面應(yīng)用最廣。易紅梅[5]針對種子胚、胚乳、芽鞘、苗等不同部位提取的DNA效果進(jìn)行了比較研究，確定了不同部位提取最好DNA的最佳時(shí)間，為進(jìn)一步推廣快提法奠定了基礎(chǔ)。

在郭景倫[1]的快提法中，采用的是96孔深孔板，一道電泳，效果明顯。而在實(shí)際操作中，為了更好地提高試驗(yàn)的便利性及經(jīng)濟(jì)性，通常采用普通PCR板（96孔、200μL），在不影響檢測結(jié)果的前提下，會(huì)涉及多道擴(kuò)增產(chǎn)物一起電泳，以節(jié)約試驗(yàn)成本。圖1所示的譜帶類型在日常電泳中經(jīng)常遇到，帶型間的拖尾現(xiàn)象逐條加重，提取DNA的質(zhì)量和純度都存在一定的問題[6]，影響帶型分析的準(zhǔn)確性。

如何改進(jìn)方法使其能夠滿足日常測純、一致性檢測等多重電泳的需要，本研究以郭景倫的快速提取方法為背景，針對一般實(shí)驗(yàn)室的基本條件和實(shí)際操作情況，采用普通PCR板（96孔、200μL），多道引物電泳，比較不同堿煮時(shí)間對快速提取DNA效果的影響，探尋適合一般實(shí)驗(yàn)室適用的檢測方法，為更加高效、準(zhǔn)確的進(jìn)行室內(nèi)測純、一致性及真實(shí)性鑒定以及高通量的DNA指紋鑒定平臺提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料 試驗(yàn)品種為農(nóng)單476，農(nóng)單476父本、農(nóng)單476母本，由安徽豐大種業(yè)公司實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)SSR引物由上海生工合成，儀器采用ZAG電泳分析儀。

1.2 DNA提取 利用刻刀取下一部分干種子的胚乳，放入96孔板（200μL）中，每孔加入DNA提取液A（0.2m/L NaOH）40μL，提取液B（0.17M/LTris-HCl）60μL，設(shè)定4種處理方式，分別按表1進(jìn)行沸水浴。提取后的DNA放4℃冰箱保存留用。

1.3 PCR擴(kuò)增 取DNA2.0μL進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)處理組從20對核心引物中選定的擴(kuò)增效果較好的3對引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用10μL體系，其中包括：DNA模板2μL、DNTP1.6μL、buffer2μL、引物0.8μL、taq酶0.1μL、ddH2O3.5μL。SSR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性、5min、1個(gè)循環(huán)，94℃變性、30S，55℃退火、30S，72℃延伸、30S，共30個(gè)循環(huán)，4℃保存。

1.4 電泳及銀染 將擴(kuò)增好的產(chǎn)物加入1μL溴酚藍(lán)指示劑，在4%PAGE丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，100w，25min，每塊膠點(diǎn)樣3道。電泳完成后取下玻璃板，在雙蒸水中快速漂洗一次，放入0.2%AgNO3中浸染10min后，再次漂洗1次后放入0.4%NaOH和0.5%甲醛的混合液中浸泡直至顯影。結(jié)束后對所有提取的DNA原液進(jìn)行稀釋1倍，重復(fù)以上操作，且對處理1組分別進(jìn)行PAGE凝膠電泳和毛細(xì)管電泳，比較兩者的應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同煮沸時(shí)間對快速提取DNA效果的影響 利用快提法取用玉米種子胚乳，設(shè)置不同的煮沸時(shí)間提取DNA并進(jìn)行PCR檢測。4個(gè)處理組，每個(gè)處理組擴(kuò)增3個(gè)引物，每板膠點(diǎn)樣3道，效果如圖2所示。由圖2可知，在處理Ⅰ和Ⅱ中，擴(kuò)增效果較好，每條帶型清晰，能夠進(jìn)行帶型分析處理，但在處理Ⅲ和Ⅳ中，第1條帶效果清晰，第2條次之，第3條模糊，3條間已相互影響，且拖尾顯現(xiàn)逐次加重。

圖2表明，每個(gè)處理組間提取的DNA含量均較高，3條帶在有相互重復(fù)的區(qū)域都存在拖尾現(xiàn)象，且處理Ⅲ和處理Ⅳ最為嚴(yán)重，第3條帶正常的分析已受到影響。對比各處理間的第1條帶，差異不大，但隨著堿煮時(shí)間的延長，每個(gè)處理間在第2、第3條帶間呈現(xiàn)出拖尾程度不同的現(xiàn)象。當(dāng)堿煮時(shí)間小于3min，即Ⅰ、Ⅱ處理，拖尾不明顯，帶型分析不受影響;當(dāng)堿煮時(shí)間大于5min時(shí)，即Ⅲ、Ⅳ處理，拖尾現(xiàn)象逐條加深，帶型分析受到影響。說明了控制堿煮時(shí)間是影響DNA提取質(zhì)量的關(guān)鍵。

分析不同煮沸時(shí)間引起的帶型差異，利用胚乳進(jìn)行煮沸快速提取DNA，由于整個(gè)提取液中含有多糖、蛋白質(zhì)、葉綠素等細(xì)胞內(nèi)含物雜質(zhì)以及一些化學(xué)物質(zhì)，隨著煮沸時(shí)間的延長，細(xì)胞的破損程度增大，內(nèi)含物的釋放量也隨之增大，整個(gè)提取液及擴(kuò)增后的產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)也逐漸增多，影響擴(kuò)增產(chǎn)物的正常電泳，致使多重電泳時(shí)，每條帶型間相互影響，影響讀帶的準(zhǔn)確性。

2.2 快速提取DNA經(jīng)稀釋后對擴(kuò)增效果的影響 從圖1中發(fā)現(xiàn)，提取的DNA濃度過高且每個(gè)處理間都存在拖尾現(xiàn)象。在PCR擴(kuò)增時(shí)若DNA含量足夠且能降低原液中各種雜質(zhì)的含量，將能進(jìn)一步提高電泳譜帶的清晰度。進(jìn)而我們對提取的DNA原液進(jìn)行稀釋1倍處理，重復(fù)試驗(yàn)過程，凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，快速提取后的DNA原液經(jīng)稀釋后，不同處理間擴(kuò)增后電泳譜帶的清晰度增加，且拖尾現(xiàn)象不同程度的得到減輕。在處理Ⅰ、Ⅱ中，帶型清晰可辨，尤其在Ⅰ中，第3條帶依然不受影響。而在處理Ⅲ、Ⅳ中，雖帶型的清晰度增加，但沒有處理Ⅰ、Ⅱ中明顯，依然存在拖尾。說明了提取的DNA原液經(jīng)稀釋后，DNA的含量能夠滿足SSR試驗(yàn)的需要，且使單位體積內(nèi)模板中雜質(zhì)含量減少，電泳后譜帶的效果更加清晰。

2.3 快提DNA稀釋前后在毛細(xì)管檢測系統(tǒng)中的應(yīng)用效果 對試驗(yàn)中處理Ⅰ組的DNA原液分別進(jìn)行稀釋前后的PCR擴(kuò)增，然后放至毛細(xì)管系統(tǒng)中進(jìn)行電泳，比較效果的差異。圖4、5表明，稀釋前的DNA經(jīng)電泳后主峰明顯，峰值較高，但存在明顯非特異峰;經(jīng)稀釋1倍后主峰較明顯，峰值適中，存在非特異性峰但不明顯，表明DNA原液稀釋后明顯的降低了非特異性峰的出現(xiàn)，使主峰更加清晰明辨。同時(shí)也證實(shí)了處理Ⅰ中提取的DNA可以用于毛細(xì)管系統(tǒng)檢測，但經(jīng)稀釋后更適合毛細(xì)管帶型分析。

3 結(jié)論與討論

3.1 控制堿煮時(shí)間能有效提高快提法提取DNA的效果 通過切取種子胚乳進(jìn)行快速提取DNA，能夠滿足日常檢測的需要，這與郭景倫、王風(fēng)格[3]等的研究一致。通過在沸水中堿煮，能夠使細(xì)胞迅速破裂[7]，釋放出包含DNA在內(nèi)的一些細(xì)胞內(nèi)含物（多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)）[8]，為下一步DNA的擴(kuò)增提供基礎(chǔ)，極大地提高了工作效率。但在一般種子企業(yè)實(shí)驗(yàn)室中，涉及到多重電泳中出現(xiàn)的拖尾問題，為此，本研究設(shè)置4種不同的堿煮時(shí)間，比較多重電泳后顯影的效果。結(jié)果表明，在普通的PCR板（96孔，200μL）上堿煮時(shí)間3min內(nèi)提取的DNA，多重電泳后拖尾現(xiàn)象不明顯，不影響正常帶型分析工作，但堿煮超過5min后，條帶間相互影響，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。

同時(shí)，在對DNA原液稀釋后再次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)處理間的條帶清晰度增加，拖尾現(xiàn)象減輕，且堿煮時(shí)間在3min內(nèi)的2組多重電泳后的條帶間幾乎不受影響。降低雜質(zhì)含量是解決拖尾現(xiàn)象的關(guān)鍵，堿煮時(shí)間越長，細(xì)胞內(nèi)含物的釋放越充分，提取的DNA中含有的雜質(zhì)量越多，擴(kuò)增及電泳受到的影響就越大。經(jīng)稀釋后，各種雜質(zhì)的含量比例降低，但DNA的含量仍能達(dá)到擴(kuò)增的需要，最終電泳顯影后效果較好。對比分析表明，堿煮的時(shí)間長短影響了最終提取DNA的質(zhì)量，針對普通PCR板，控制堿煮時(shí)間3min內(nèi)，再進(jìn)行稀釋1倍處理，電泳效果最好，不影響日常檢測工作的準(zhǔn)確性。

3.2 切粒快提法在現(xiàn)代檢測儀器中的利用 隨著快提法的推廣應(yīng)用，不僅在純度、一致性及真實(shí)性檢測上提高了檢測效率，而且能夠在分子選育上使室內(nèi)和田間有效的結(jié)合，胚沒有損傷的種子仍能種到田間觀察表現(xiàn)[9]。但隨著現(xiàn)代檢測儀器毛細(xì)管電泳[10]的使用，如高通量檢測儀器3730L、ZAG等，使得檢測準(zhǔn)確率得到了極大的提升，同時(shí)也對擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量提出了一定的要求。通過切粒沸水堿煮提取DNA，提取液中除了含有一些可溶類雜質(zhì)外，其中仍含有切除不可溶解的胚或胚乳微粒，致使在擴(kuò)增時(shí)吸取的DNA模板將會(huì)含有這些可溶或不可溶物質(zhì)。由于毛細(xì)管電泳儀器的精密性，維護(hù)成本較高，結(jié)合儀器自身特性，細(xì)小的微?？赡軙?huì)造成毛細(xì)管孔堵塞，增大儀器的使用風(fēng)險(xiǎn)。在日常利用毛細(xì)管的檢測中，盡可能的使用胚芽或葉片進(jìn)行快提，前人的研究[5]已經(jīng)證實(shí)，發(fā)芽3d左右的嫩葉提取的DNA完全滿足SSR的要求且適合毛細(xì)管系統(tǒng)檢測。切粒提取的DNA原液，可以對其進(jìn)行1～1.5倍的稀釋，以降低模板不可溶物質(zhì)的含量，在不影響檢測準(zhǔn)確度的基礎(chǔ)上，盡量減少毛細(xì)管儀器的使用風(fēng)險(xiǎn)。

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（責(zé)編：張宏民）