趙雅姣，劉曉靜，童長春，吳 勇

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

豆科‖禾本科間作可以通過種間競爭提高豆科作物固氮能力，減少氮素的投入及降低土壤中硝酸鹽含量等[1]，因此，不論是從資源利用方面還是對環(huán)境貢獻等方面，豆科‖禾本科間作種植方式被研究者越來越重視[2]。豆科‖非豆科間作在發(fā)達國家已成為優(yōu)質(zhì)牧草生產(chǎn)的重要發(fā)展方向，有利于改善牧草的蛋白含量。有關(guān)多年生豆科牧草與一年生禾本科牧草間作的研究也較多。例如，三葉草(Trifoliumrepens)與黑麥草(Loliummultiflorum)和燕麥(Avenasativa)混種后獲得營養(yǎng)平衡的飼草[3]；柱花草(Stybsanthesguianensis)與扭黃茅(Heteropogoncontortus)間作可提高單位面積牧草產(chǎn)量和禾本科牧草氮磷的吸收，有利于改善牧草品質(zhì)[4]；紫花苜蓿(Medicagosativa)和玉米(Zeamays)間作下，經(jīng)濟產(chǎn)出大于單作紫花苜蓿和單作玉米[5]。玉米是需氮量較大的C4作物，適量的供氮有利于促進其葉綠體合成。玉米為須根系，將其與豆科植物間作會增加玉米根系水平和垂直尺度的生態(tài)位，增加玉米對氮素的吸收，減少氮的損失[6]。紫花苜蓿與玉米間作體系中玉米為優(yōu)勢種，因此其競爭養(yǎng)分能力較強，營養(yǎng)狀況得到改善。玉米與紫花苜蓿的間作復(fù)合群體與單作群體比較，粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量及鮮草和干草產(chǎn)量差異達到顯著或極顯著水平[7]。

氮素的吸收及利用與玉米體內(nèi)氮代謝及氮代謝相關(guān)酶有密切關(guān)系。氮代謝為作物體內(nèi)最基本代謝途徑，其不僅影響作物的生長發(fā)育，而且也決定著作物產(chǎn)量和品質(zhì)[8]。影響氮代謝的相關(guān)酶主要有硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)。植物從土壤中吸收氮素后，通過NR、NiR、GS、GOGAT等的作用轉(zhuǎn)運氮素到儲藏器官中供植物生長發(fā)育的需要。NR和GS作為高等植物氮代謝途徑中氮素初始同化中的關(guān)鍵酶，是一切無機氮素進入高等植物體內(nèi)的“門戶”，影響著植物氮素營養(yǎng)的吸收、同化及利用效率，對作物的生長發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)等農(nóng)藝性狀具有決定性作用[9]。植物體中的氮素在氮代謝相關(guān)酶的催化作用下合成有機氮，成為蛋白質(zhì)的重要組分。因此，植物的氮代謝產(chǎn)物及相關(guān)酶活性的變化，對牧草的產(chǎn)量及品質(zhì)的高低及優(yōu)劣起著重要調(diào)節(jié)作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)玉米花生間作能夠提高玉米功能葉片的NR和GS活性，促進了無機氮向蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。王春麗[12]研究發(fā)現(xiàn)，間作玉米穗部葉片的NR活性受生長空間和資源競爭的改善比單作有所提高，豆科和禾本科間作下禾本科的氮吸收能力和氮代謝酶活性普遍高于單作[13]。為了探明玉米間作中氮素的高效利用，需對玉米本身氮代謝相關(guān)酶的變化規(guī)律進行認識[14]。目前，有關(guān)豆‖禾間作在糧食作物中的研究較多，而在牧草作物中的研究較少；間作對氮代謝差異的研究較多，而有關(guān)氮代謝酶活性在間作中的變化研究較少；間作對地上氮代謝差異研究較多，而對地下氮代謝差異研究較少。因此，通過根系分隔技術(shù)及玉米單作研究，地上互作和地下互作對玉米地上地下氮代謝產(chǎn)物及關(guān)鍵酶活性的影響，了解間作紫花苜蓿對玉米氮代謝產(chǎn)物及關(guān)鍵酶活性的變化規(guī)律及聯(lián)系，揭示間作對禾本科作物氮代謝促進作用的實質(zhì)，為該領(lǐng)域相關(guān)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

紫花苜蓿為LW6010，由北京猛犸種業(yè)有限公司提供；玉米為KD-3，由河南省農(nóng)業(yè)科學院提供；根瘤菌為中華根瘤菌12531，由甘肅農(nóng)業(yè)大學提供。

1.2 試驗設(shè)計

采用營養(yǎng)液砂培法于甘肅農(nóng)業(yè)大學植物生長室中進行，材料種植于塑料桶中(直徑32 cm，高20 cm)。試驗設(shè)置2個氮素水平，4種種植方式，每個處理重復(fù)3次。2個氮素水平是(1)N21，低N水平，21 mg N/L，(2)N210，正常N水平(紫花苜蓿適宜氮水平)，210 mg N/L。N21和N210營養(yǎng)液均使用Hoagland-Arnon營養(yǎng)液為基本營養(yǎng)液，NO3--N∶NH4+-N的比例為1∶1。4種種植方式為(1)玉米單作，(2)紫花苜?！衩组g作根系不分隔，簡稱不分隔(3)紫花苜?！衩组g作根系尼龍網(wǎng)分隔，簡稱尼龍網(wǎng)分隔，(4)紫花苜?！衩组g作塑料分隔，簡稱塑料分隔。玉米單作每桶留8株玉米，均勻種植于塑料桶中。不分隔、尼龍網(wǎng)分隔和塑料分隔每桶各留10株紫花苜蓿和4株玉米分別均勻種植于屏障的兩側(cè)。其中，根系分隔的種植方式參考李隆等[15]團隊的相關(guān)研究。

紫花苜蓿2018年3月1日播種，玉米為2018年5月5日播種。試驗設(shè)3個取樣日期，2018年6月13日，6月28日和7月13日進行各指標的測定，紫花苜蓿的3個取樣時期分為分枝期、現(xiàn)蕾期和初花期，而玉米分別為苗期、拔節(jié)期和孕穗期。在紫花苜蓿出苗后7 d，向桶中加入N營養(yǎng)液(每桶1 000 mL)，然后接種根瘤菌(每桶25 mL)，后每周更換1次營養(yǎng)液，共換17次營養(yǎng)液。取玉米植株功能葉片(穗位葉)及根尖部位進行氮代謝酶活性的測定。

1.3 測定指標

硝酸還原酶(NR)：采用鄒琦[16]的方法，單位：μg/(g FW·h)。

亞硝酸還原酶(NIR)：參照Rajasekhar[17]的方法，單位：μg/(g·h)。

谷氨酰胺合成酶(GS)：參照鄒琦[16]的方法，單位：μmol/(g FW ·h)。

谷氨酸合酶(GOGAT)：參考鄭朝峰等[18]方法，單位：umol/(L·min)。

地上干物質(zhì)重：采用烘干法測定。

地上氮積累量：采用半微量凱式定氮法測定全氮含量[19]，地上氮積累量為地上干物質(zhì)重與地上氮含量的乘積。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2007軟件整理后，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(ANOVE)和pearson相關(guān)性分析(雙側(cè)檢驗)，并用LSD法進行差異顯著性測驗，顯著性水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米NO3-相關(guān)酶活性的變化

隨著生育期的推進，玉米地上、地下的NR、NiR、GS和GOGAT活性均隨著生育期的推進不斷增加，并且其在不同種植方式下均表現(xiàn)為不分隔>尼龍網(wǎng)分隔>塑料分隔和玉米單作。玉米地上部和地下部的NR活性在不同氮素水平和不同種植方式下均差異極顯著(P<0.01)(表1)。氮素水平×種植方式互作，除苗期玉米的地上部分NR活性差異極顯著外(P<0.01)，其余均差異不顯著。玉米地上部NR活性，在2個氮素水平下均表現(xiàn)為不分隔顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)；在N210水平下，塑料分隔和玉米單作差異不顯著；而在N21水平下，塑料分隔顯著大于玉米單作(P<0.05)。

玉米的NiR活性在氮素水平和種植方式下均表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01)，氮素水平×種植方式互作在苗期的地下部分表現(xiàn)為差異顯著(P<0.05)，而苗期的地上部、拔節(jié)期和孕穗期的地上部及地下部均表現(xiàn)為差異不顯著(表2)。玉米的地上部NiR活性在N210和N21下均表現(xiàn)為不分隔顯著大于尼龍網(wǎng)分隔，顯著大于塑料分隔，顯著大于玉米單作(P<0.05)。而玉米地下部NiR活性表現(xiàn)為不分隔顯著大于尼龍網(wǎng)分隔，顯著大于塑料分隔(P<0.05)。N21下，玉米地下部NiR活性在尼龍網(wǎng)分隔和塑料分隔下差異顯著。

注：*和**表示差異顯著和差異極顯著，下同

表2 不同種植方式及氮素水平處理下玉米的NiR

2.2 玉米NH4+相關(guān)酶活性的變化

玉米地上部和地下部GS活性在氮素水平和種植方式下均表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01)，而在氮素水平×種植方式互作下各時期GS活性均差異不顯著(表3)。玉米地上部GS活性在N210下表現(xiàn)為不分隔顯著大于尼龍網(wǎng)分隔，顯著大于塑料分隔，顯著大于玉米單作(P<0.05)。而玉米地上部GS活性在N21下表現(xiàn)為不分隔顯著大于尼龍網(wǎng)分隔，顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)，塑料分隔和玉米單作差異不顯著。玉米地下部GS活性表現(xiàn)在N210和N21下均表現(xiàn)為不分隔顯著大于尼龍分隔，顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)。其中，拔節(jié)期時塑料分隔和玉米單作差異不顯著，而孕穗期時塑料分隔顯著大于玉米單作(P<0.05)。

玉米GOGAT活性在氮素水平和種植方式下均表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01)(表4)。玉米地上部GOGAT活性在拔節(jié)期和孕穗期時，氮素水平×種植方式互作差異極顯著，而在地上部的苗期及地下部的各生育期均表現(xiàn)為差異顯著(P<0.05)。玉米地上部GOGAT活性除苗期的N210水平，其余均表現(xiàn)為不分隔顯著大于尼龍網(wǎng)分隔(P<0.05)。玉米地上部GOGAT活性在苗期和拔節(jié)期，塑料分隔和玉米單作差異均不顯著，而孕穗期塑料分隔顯著大于玉米單作(P<0.05)。玉米地下部GOGAT活性，在N210下不分隔均顯著大于尼龍網(wǎng)分隔；而在N21下，苗期和拔節(jié)期不分隔和尼龍網(wǎng)分隔差異不顯著，孕穗期不分隔顯著大于尼龍網(wǎng)分隔(P<0.05)。玉米地下部GOGAT活性在2個氮素水平和各生育期時，塑料分隔和玉米單作差異均不顯著。

表3 不同種植方式及氮素水平處理下玉米的GS

表4 不同種植方式及氮素水平處理下玉米的GOGAT

2.3 玉米干物質(zhì)重的變化

玉米干物質(zhì)重隨生育期的推進而增大，苗期到拔節(jié)期的增長速度較小，而拔節(jié)期到孕穗期的增長速度較大。玉米地上地下干物質(zhì)重在各分隔方式中表現(xiàn)為不分隔>尼龍網(wǎng)分隔>塑料分隔>玉米單作。其中，玉米地上干物質(zhì)重在N210和N21下，苗期時，各種植方式間均差異不顯著；拔節(jié)期時，不分隔顯著大于尼龍網(wǎng)分隔，顯著大于玉米單作(P<0.05)，塑料分隔和玉米單作差異不顯著；孕穗期時，不分隔顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)，塑料分隔和玉米單作差異不顯著。玉米地下干物質(zhì)重在2個氮素水平和各生育期下表現(xiàn)為不分隔顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)，不分隔和尼龍網(wǎng)分隔差異不顯著，塑料分隔和玉米單作差異不顯著(圖1)。

2.4 玉米氮含量的變化

不同種植方式玉米氮含量隨著生育期的推進而不斷下降(圖2)。玉米氮含量在各種植方式下的變化規(guī)律與干物質(zhì)重的變化規(guī)律相似，均為不分隔>尼龍網(wǎng)分隔>塑料分隔>玉米單作。玉米地上氮含量在N210下，苗期時不分隔顯著大于玉米單作(P<0.05)，而與尼龍網(wǎng)分隔和塑料分隔差異不顯著；拔節(jié)期和孕穗期時，不分隔顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)，而不分隔和尼龍網(wǎng)分隔、塑料分隔和玉米單作差異不顯著。玉米地上部氮含量在N21下，各生育期均表現(xiàn)為不分隔顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)。玉米地下部氮含量在N210和N21下，各生育期的不分隔時顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)；苗期和孕穗期時不分隔顯著大于尼龍網(wǎng)分隔(P<0.05)，而在拔節(jié)期時不分隔與尼龍網(wǎng)分隔差異不顯著。

圖1 不同種植方式及氮水平處理下玉米的干物質(zhì)Fig.1 Effect of different cropping patterns and nitrogen levels on dry matter yield of maize

圖2 不同種植方式及氮水平處理下玉米的氮含量Fig.2 Effect of different cropping patterns and nitrogen levels on N content of maize

2.4 玉米氮積累量的變化

玉米氮積累量隨生育期的推進不斷增大。玉米地上氮積累量除苗期的N210水平外，其余均表現(xiàn)為不分隔顯著大于尼龍網(wǎng)分隔，顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)，塑料分隔和玉米單作差異不顯著。玉米地下部氮積累量在N210和N21下，苗期和孕穗期表現(xiàn)為不分隔顯著大于尼龍網(wǎng)分隔，顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)；而在拔節(jié)期不分隔顯著大于塑料分隔和玉米單作(P<0.05)，不分隔和尼龍網(wǎng)分隔差異不顯著(圖3)。

圖3 不同種植方式及氮水平處理下玉米的氮積累量Fig.3 Effect of different cropping patterns and nitrogen levels on N accumulation of maize

3 討論

NR、NiR、GS、GOGAT是從無機氮變?yōu)橛袡C氮過程中最重要氮代謝相關(guān)酶[20]。玉米地上部、地下部NR、NiR、GS和GOGAT活性在不同生育期和氮素水平下均表現(xiàn)為不分隔>尼龍網(wǎng)分隔>塑料分隔≥玉米單作。在3種分隔方式中，不分隔、尼龍網(wǎng)分隔和塑料分隔無地上互作差異，而有地下互作差異，而出現(xiàn)4種氮代謝相關(guān)酶活性在3種分隔方式下的活性不同是由于玉米與紫花苜蓿地下互作的強度不一樣，因而玉米對氮素的競爭也不一樣，從而導(dǎo)致氮代謝相關(guān)酶活性的差異。不分隔時，玉米和紫花苜蓿根部相互交叉重疊，從而增大了玉米對紫花苜蓿氮素的競爭；而尼龍網(wǎng)分隔時，兩種作物的根系無相互交叉重疊，但玉米依然可以競爭紫花苜蓿周圍的氮素，然而其在尼龍網(wǎng)分隔時的競爭能力弱于其在不分隔時的競爭能力；而玉米在塑料分隔時，玉米無法競爭紫花苜蓿根系的氮素。因此，玉米的4種氮代謝相關(guān)酶活性在不分隔時競爭到的氮素高于尼龍網(wǎng)分隔，塑料分隔。而氮代謝相關(guān)酶活性主要受氮濃度的影響[21]，劉勝波[22]研究表明，NR活性與其底物的氮素濃度呈正相關(guān)；其他研究學者也證實NR和GS活性隨氮濃度的增高而增高[23-26]；研究中，不同種植模式下正常氮處理的玉米氮代謝相關(guān)酶活性均高于低氮處理，進一步證明提高氮素水平有利于提高玉米氮代謝相關(guān)酶活性。因此，得出紫花苜蓿與玉米根系互作越緊密，玉米對氮素的競爭越大，玉米氮含量越高，其氮代謝酶活性也越大。唐秀梅等[27]對木薯‖花生間作研究發(fā)現(xiàn)，間作下木薯葉片NR和GS活性顯著增加，并且根系間的相互作用越大其NR和GS活性越高，說明兩種作物互作提高了NR和GS活性，這與本研究結(jié)果一致。

玉米的4種氮代謝相關(guān)酶活性在塑料分隔時大于玉米單作，主要是由于地上互作引起的。玉米在塑料分隔和單作時，均與紫花苜蓿無地下互作，而塑料分隔時玉米與紫花苜蓿有地上互作，玉米作為高位作物可以獲得更多的光照，并可以加快碳水化合物和氮代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，因而提高氮代謝相關(guān)酶活性；而玉米單作時，地上部無光合優(yōu)勢。因此，玉米4種氮代謝相關(guān)酶活性也受地上條件的影響，從而表現(xiàn)為塑料分隔大于玉米單作。關(guān)義新等[28]研究報道弱光下玉米幼苗葉片中NR活性較低，不利于植株的氮同化作用。全曉艷[29]研究報道弱光下水稻籽粒GS活性低于正常光照下的，且遮光程度越大，酶活性越低，不利于植株對氮素的吸收和同化。試驗中玉米不同氮代謝相關(guān)酶活性在不分隔和尼龍網(wǎng)分隔時均顯著大于塑料分隔和單作，而塑料分隔與單作之間的差異較小。孕穗期時，NR的地下部、GS的地下部和GOGAT的地上部在塑料分隔下顯著大于玉米單作，說明氮代謝的酶活性隨生育期的增加，其差距也在增加。由此可見，地下互作對氮代謝相關(guān)酶活性的影響程度較大，不分隔可增加作物根系對土壤養(yǎng)分的吸收，進而提高作物的氮代謝水平，同時提高了作物的氮代謝相關(guān)酶活性，加速了蛋白質(zhì)的合成，提高了氮含量和氮積累量；而地上互作對氮代謝相關(guān)酶活性的影響相對較小，但由于玉米與紫花苜蓿株高間差距不斷增大，其影響也逐漸增大。宋航也有類似研究，即遮光使玉米穗位葉NR和GS活性降低；而增氮肥使玉米NR和GS活性升高；弱光下隨施氮量增加玉米的NR和GS活性同樣增強[30]。

玉米的地上部和地下部的干物質(zhì)重、氮含量和氮積累量在不同氮水平和種植方式下的表現(xiàn)與4種氮代謝相關(guān)酶一致。表明氮代謝相關(guān)酶活性的增高有利于提高作物的生物量及氮積累量，這是由于氮代謝產(chǎn)物的形成與4種氮代謝相關(guān)酶對氮素的轉(zhuǎn)化途徑有關(guān)，并且NR與NiR之間，GS與GOGAT之間均具有耦合關(guān)系。秦永梅等[31]研究報道，GS活性的變化趨勢與NR活性基本相似，進一步說明了該2種酶共同完成氮同化途徑。并且，由于玉米在間作體系中表現(xiàn)出較強的競爭能力，玉米在不分隔時根系可以有效地促進紫花苜蓿地根瘤固氮，因而吸收利用較多的氮素，提高體內(nèi)氮素含量，從而促進氮代謝相關(guān)酶的活性，最終增加其生物量及氮積累量。不同種植模式中正常氮處理時玉米氮代謝產(chǎn)物均高于低氮處理，這與氮代謝相關(guān)酶活性在2個氮水平下的表現(xiàn)也一樣，說明氮代謝相關(guān)酶活性與氮代謝產(chǎn)物有著密切的關(guān)系。肖焱波等[32]報道了小麥與蠶豆間作中含氮量，發(fā)現(xiàn)小麥含氮量在不分隔時最高，根系相互作用改善了小麥生長。因此，可以得到，玉米的氮代謝相關(guān)酶活性可以直接反應(yīng)其氮代謝的能力。

4 結(jié)論

紫花苜蓿‖玉米在不同氮素水平及不同種植方式下，其氮代謝相關(guān)酶活性及氮代謝產(chǎn)物均表現(xiàn)為常氮水平>低氮水平，不分隔>尼龍網(wǎng)分隔大于塑料分隔和玉米單作。因此，紫花苜?！衩组g作可以提高玉米氮代謝相關(guān)酶活性以及氮代謝產(chǎn)物的積累。說明紫花苜蓿‖玉米中根系互作越緊密、氮素濃度越高，越有利于玉米的氮代謝相關(guān)酶活性的提高以及氮代謝產(chǎn)物的積累；氮代謝相關(guān)酶活性可以直接反應(yīng)其氮代謝的能力。