周笑犁，盧穎，朱坤瓏，王金華，杜斌，林棟

（貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550005）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）屬于薔薇屬植物[1]，主要在西南地區(qū)有分布，其中貴州地區(qū)的刺梨產(chǎn)量尤為突出[2]。刺梨鮮果中有著豐富的維生素、多糖、有機(jī)酸、酚類、氨基酸和微量元素等營養(yǎng)成分[3-4]。多糖除具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)外，還有著降血糖、抗衰老等功效，而且對機(jī)體的副作用較小，因此多糖的開發(fā)成為了功能食品乃至新藥制品中極具發(fā)展?jié)摿Φ姆较騕5-7]。刺梨作為貴州省藥食兩用資源被大力研究并開發(fā)的果品之一，其刺梨多糖是鮮果中主要的一種水溶性成分，楊江濤[6]報(bào)道了刺梨粗多糖具有提高衰老小鼠體內(nèi)抗氧化的能力；陳代雄等[8]發(fā)現(xiàn)刺梨多糖可以增強(qiáng)動(dòng)物的非特異性免疫和體液免疫應(yīng)答；崔昊等[9]也發(fā)現(xiàn)刺梨多糖對補(bǔ)體途徑和替代途徑均有著積極的作用；而關(guān)于刺梨多糖的提取分離方面，分別用熱水浸提、微波法、超聲法、酶法4 種提取方法對所提取的刺梨多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行比較[10-11]，對刺梨多糖的純化主要在分級沉淀、柱層析等[6]。由于多糖自身的結(jié)構(gòu)較復(fù)雜、種類較多，其提取液中還含有寡糖、膠體等物質(zhì)[12]。在本試驗(yàn)中主要以刺梨加工副產(chǎn)物——果渣為試材，若采用耗時(shí)較長且工藝繁瑣的純化工藝必然會(huì)增加果品副產(chǎn)物再開發(fā)的成本，因此本研究在前期熱水浸提法對刺梨果渣多糖提取工藝的基礎(chǔ)上，加入安琪酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，菌種在生長和代謝的過程中會(huì)利用單糖、雙糖等小分子糖，還可將一些組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物，從而達(dá)到制備刺梨果渣多糖并提高其活性的目的[12-13]，該發(fā)酵法作為初步的純化耗能較低、操作簡易。通過探討液態(tài)發(fā)酵法制備刺梨果渣多糖的最佳工藝，可為刺梨果渣多糖的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為刺梨的綜合利用，尤其是果渣多糖等功效產(chǎn)品開辟新途徑。

隨著生活節(jié)奏的增加，環(huán)境的變化以及年齡的增長，機(jī)體在活動(dòng)和代謝過程中會(huì)產(chǎn)生較多的氧自由基，但對于健康機(jī)體而言其維持著一定的平衡關(guān)系，當(dāng)其平衡被打破后則有著較強(qiáng)的破壞性，對機(jī)體的生物膜系統(tǒng)造成損傷[14]，導(dǎo)致慢性疾病的發(fā)生。因此從天然資源中提取多糖等功效組分作為自由基清除劑，尤其從果蔬廢棄資源中提取活性成分，不僅能夠提高果蔬資源的綜合利用，還為食品添加劑的研制及進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨果渣：貴州省果品加工工程研究中心開發(fā)刺梨飲品加工后的副產(chǎn)物，經(jīng)微波真空干燥至恒重，粉碎，制成刺梨果渣粉，備用。

安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；蒽酮、濃硫酸、葡萄糖、檸檬酸鈉、無水乙醇、DPPH、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵均為國產(chǎn)分析純。

LDZX-30KBS 高壓滅菌鍋：上海申安有限公司；TGL-16C 高速臺(tái)式離心機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；UV-2550 紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；SW-CJ-1G 超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺梨果渣多糖液及發(fā)酵原液的準(zhǔn)備

通過前期研究熱水浸提法對果渣多糖的提取工藝[料液比 1∶20（g/mL），60 ℃恒溫水浴浸提 2 h]制備刺梨果渣多糖液。

發(fā)酵原液[13]：在100 mL 刺梨果渣多糖液中加入1 g葡萄糖、1 g 蛋白胨和0.5 g 酵母膏，115 ℃滅菌15 min后用于酵母發(fā)酵工藝的研究。

1.2.2 發(fā)酵菌種的制備

取安琪酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，其菌數(shù)含量為 106個(gè)/mL～107個(gè)/mL。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 接種量對果渣多糖含量的影響

分別加入1%、2%、3%、4%、5%酵母菌種液到刺梨果渣多糖原液中，30 ℃培養(yǎng)60 h，pH 5.0，考察接種量對發(fā)酵液中多糖含量的影響。

1.2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對果渣多糖含量的影響

刺梨果渣多糖發(fā)酵原液中加入3%酵母菌種液，pH 5.0，于 30 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 48、60、72、84、96 h，考察發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵液中多糖含量的影響。

1.2.3.3 pH 值對果渣多糖含量的影響

刺梨果渣多糖發(fā)酵原液中加入3%的酵母菌種液，于 30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 60 h，pH 值分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，考察初始pH 值對發(fā)酵液中多糖含量的影響。

1.2.3.4 發(fā)酵溫度對果渣多糖含量的影響

刺梨果渣多糖發(fā)酵原液中加入3 %的酵母菌種液，pH 5.0，分別在 25.0、27.5、30.0、32.5、35.0 ℃條件下培養(yǎng)60 h，考察溫度對發(fā)酵液中多糖含量的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以發(fā)酵液中多糖含量為指標(biāo)，L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，如表1所示。

表1 刺梨果渣多糖發(fā)酵法制備正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

由正交試驗(yàn)分析所確定的貴州產(chǎn)刺梨果渣多糖的酵母發(fā)酵法工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.6 多糖含量的測定

采用蒽酮-硫酸顯色法[15-16]測定，以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到方程y=0.026 2x+0.000 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 4。通過該線性方程計(jì)算發(fā)酵液中多糖的含量。

1.2.7 刺梨果渣多糖的制備

對酵母菌發(fā)酵制備的刺梨果渣多糖進(jìn)行濃縮處理，然后加入無水乙醇進(jìn)行醇沉過夜[17-18]，離心分離干燥后制得刺梨果渣多糖（即刺梨果渣多糖A）。

將刺梨果渣多糖A 中加入無水石油醚進(jìn)行脫脂處理，重復(fù)3 次。然后采用Sevag 法脫蛋白[17-18]。最后得到的多糖液加入乙醇進(jìn)行醇沉，重復(fù)3 次以除去Sevag 試劑，最后得到脫脂脫蛋白的刺梨果渣多糖（即刺梨果渣多糖B）。

1.2.8 抗氧化性分析

1.2.8.1 還原能力的測定

分別取不同濃度的果渣多糖樣品，依次加入0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL 和1 %六氰合鐵酸鉀溶液2.5 mL，50 ℃下反應(yīng)20 min，快速冷卻再加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻，3 000 r/min 離心10 min，依次加入蒸餾水2.5 mL 和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL到上清液中，混合均勻后靜置10 min，測定700 nm 波長處的吸光值[19]。

1.2.8.2 DPPH 自由基的清除作用

用無水乙醇溶解1 mg DPPH 后定容至25 mL 用作母液，然后吸取DPPH 母液2 mL 定容至100 mL，分別吸取DPPH 溶液2 mL 和2 mL 乙醇或不同濃度的果渣多糖樣品，用力搖勻，避光反應(yīng)30 min，以乙醇作為空白，在波長517 nm 處測定其吸光值；DPPH 溶液2 mL 和乙醇2 mL 的吸光度記為A0；多糖樣品液2 mL與DPPH 溶液2 mL 混合后以同樣的方法測定其吸光值記為Ai；乙醇2 mL+多糖樣品液吸光值2 mL 為Aj。清除率/%=[A0-（Ai-A）j]/A0×100[20-21]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以p＜0.05 作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 接種量對多糖含量的影響

接種量對多糖含量的影響見圖1。

圖1 接種量對多糖含量的影響Fig.1 Effects of inoculating volume on the polysaccharide yield

如圖1所示，隨著酵母菌接種量的增加多糖的含量呈逐漸上升的趨勢。接種量為1%時(shí)多糖含量顯著低于其他各組（p＜0.05）；當(dāng)接種量為3%時(shí)多糖的含量最高（p＜0.05）；接種量大于3%時(shí)，其含量則呈下降趨勢（p＞0.05）。這可能是由于酵母菌接種量較低時(shí)菌種和原料接觸不充分，而接種量過大則導(dǎo)致在有限的營養(yǎng)物質(zhì)下酵母菌生長受到限制，從而致使后續(xù)發(fā)酵制備動(dòng)力的不足，也可能由于菌種的不斷增殖產(chǎn)生了次級代謝產(chǎn)物，而產(chǎn)物的不斷積累缺抑制了試驗(yàn)菌種的正常生長[12-13]，故選擇3%、4%和5%的接種量作為正交試驗(yàn)的3 個(gè)水平。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對多糖含量的影響

發(fā)酵時(shí)間對多糖含量的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對制備多糖含量的影響Fig.2 Effects of fermentation time on the polysaccharide yield

發(fā)酵時(shí)間的逐漸延長，發(fā)酵液中多糖的含量逐漸降低后有回升的趨勢，但各組間多糖的含量均差異不顯著（p＞0.05）。說明酵母菌在生長的過程中主要以單糖和雙糖為優(yōu)勢碳源，而對三糖的利用則因酵母菌的種類不同而存在著一定的差異[12]，本試驗(yàn)中可能由于刺梨果渣多糖發(fā)酵液中酵母菌在48 h 已趨于穩(wěn)定，因此后續(xù)發(fā)酵相對平緩，致使多糖含量的變化沒有顯著性差異（p＞0.05）。選擇多糖含量值最高的3 組即48、84 h 和96 h 的發(fā)酵時(shí)間作為下一步正交試驗(yàn)的3 個(gè)水平。

2.1.3 初始pH 值對多糖含量的影響

pH 值對多糖含量的影響見圖3。

隨著pH 值的增加，酵母發(fā)酵制備多糖的含量逐漸增加（p＜0.05），直到 pH 值大于 6.0 時(shí)多糖的含量顯著低于其他各組（p＜0.05），這可能是因?yàn)榻湍妇m宜在偏酸性環(huán)境生長的原因，在pH 值為中性時(shí)的發(fā)酵原液則影響了酵母菌細(xì)胞質(zhì)膜電荷及其穩(wěn)定性和菌體的代謝酶活性，從而改變了酵母菌對發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用情況。在pH 值為5.0 時(shí)，酵母菌的生長情況最佳，其多糖含量顯著高于其他各組（p＜0.05）。

圖3 pH 值對多糖含量的影響Fig.3 Effects of pH value on the polysaccharide yield

2.1.4 發(fā)酵溫度對多糖含量的影響

發(fā)酵溫度對多糖含量的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對多糖含量的影響Fig.4 Effects of fermentation temperature on the polysaccharide yield

由于酵母菌屬于真核微生物，故取25 ℃～35 ℃作為制備工藝的溫度優(yōu)化范圍。如圖4所示，該溫度區(qū)間較適合進(jìn)行酵母菌發(fā)酵多糖，多糖含量在30 ℃時(shí)達(dá)到最大（p＜0.05），說明更利于酵母利用小分子的糖類。溫度在25 ℃～30 ℃時(shí)，發(fā)酵制備液中多糖的含量隨溫度的升高而逐漸增加，可能是緣于該溫度范圍不能達(dá)到酵母菌的最適生長溫度，從而使得酵母菌利用單糖的能力較低；當(dāng)溫度30 ℃～35 ℃時(shí)，發(fā)酵制備液中多糖的含量卻緩慢降低，可能是該溫度不利于酵母菌自身的生長，從而導(dǎo)致代謝活性不高。

2.2 正交試驗(yàn)

通過對酵母菌發(fā)酵法制備貴州產(chǎn)刺梨果渣多糖的酵母菌種添加量、發(fā)酵液起始pH 值、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度4 個(gè)因素進(jìn)行單因素分析后，對較優(yōu)的3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，見表1。試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析見表2，對貴州產(chǎn)刺梨果渣多糖的酵母發(fā)酵法制備主次順序A＞D＞C＞B，即菌種接種量＞pH 值＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度；并得出酵母發(fā)酵制備果渣多糖的最適工藝條件為A1B3C2D1，即酵母菌液的添加量為3%，發(fā)酵溫度為32.5 ℃，發(fā)酵時(shí)間為 84 h，發(fā)酵起始 pH 為 4。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表Table 2 The orthogonal experiment results analysis table

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

本試驗(yàn)利用酵母菌生長過程中會(huì)利用多糖原液中的單糖、雙糖等[12]，使得果渣多糖的純度提高，這為后期刺梨果渣廢棄物開發(fā)工藝奠定了基礎(chǔ)。通過正交試驗(yàn)確定酵母菌發(fā)酵法制備果渣多糖的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，由3%酵母菌液添加到刺梨果渣多糖發(fā)酵原液中，pH 值為4，在32.5 ℃的培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)酵純化84 h，得到刺梨果渣多糖的含量為（3.19±0.1）mg/mL，均高于正交試驗(yàn)中各組的多糖含量。

2.4 酵母發(fā)酵純化刺梨果渣多糖的抗氧化活性

2.4.1 還原能力

刺梨果渣多糖的還原能力見圖5。

圖5 刺梨果渣多糖的還原能力Fig.5 The reducing power of polysaccharides extracted from Rosa roxburghii Tratt residue

不同濃度的各組刺梨果渣多糖均具有還原能力，并且有著一定的劑量依賴關(guān)系，隨著濃度的增加，還原能力逐漸增大（p＜0.05）。經(jīng)過發(fā)酵制備的刺梨果渣多糖將Fe3+還原為Fe2+的能力優(yōu)于多糖原液，尤其在0.5、1.0 mg/mL 時(shí)顯著增加（p＜0.05）；而與唐健波等[10]報(bào)道的微波、超聲法提取刺梨多糖的還原能力相比，0.1、0.5 mg/mL 發(fā)酵制備多糖較優(yōu)，但低于張匯慧[22]報(bào)道的刺梨黃酮的還原能力，并且，對發(fā)酵制備多糖進(jìn)行脫脂脫蛋白處理后（刺梨果渣多糖B）的還原能力均顯著高于其他各組（p＜0.05）；說明經(jīng)過酵母菌制備的多糖具有良好的還原能力。

2.4.2 對DPPH 自由基清除能力

刺梨果渣多糖對DPPH 自由基的清除能力見圖6。

圖6 刺梨果渣多糖對DPPH 自由基的清除能力Fig.6 The DPPH radical scavenging effect of polysaccharides extracted from Rosa roxburghii Tratt residue

本試驗(yàn)中多糖原液、發(fā)酵制備多糖（A）及其脫脂脫蛋白后的多糖（B）對DPPH 自由基的清除能力分別為60 %、70 %和80 %左右，且發(fā)酵前后差異顯著（p＜0.05），說明多糖對自由基的清除能力與其純度有關(guān)，純度越大清除能力越強(qiáng)；或者利用微生物對多糖原液進(jìn)行發(fā)酵的過程中產(chǎn)生了一些次級代謝產(chǎn)物，而這些代謝產(chǎn)物也有一定的抗氧化能力[13]，本試驗(yàn)的結(jié)果與鐵皮石斛發(fā)酵制備所得多糖的抗氧化活性更強(qiáng)相似[13]。發(fā)酵制備多糖對DPPH 自由基清除能力優(yōu)于5 mg/mL 薏苡仁多糖液[23]，低于 1 mg/mL 紫甘薯花色苷[24]、0.08 mg/mL 藍(lán)莓酒渣花色苷[25]及刺梨黃酮[22]對DPPH 自由基的清除率，說明刺梨果渣多糖的抗氧化作用弱于花色苷等活性物質(zhì)。另外，隨著多糖原液和發(fā)酵液濃度的增加，其自由基清除率增大，但差異不顯著（p＞0.05），經(jīng)過脫脂脫蛋白發(fā)酵多糖的清除率達(dá)到最大（p＜0.05），可能由于多糖原液樣品中所含的蛋白質(zhì)或脂類阻礙了對自由基的清除效果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)（接種量、起始pH 值、發(fā)酵時(shí)間和溫度）的基礎(chǔ)上，通過L9（34）正交試驗(yàn)選出采用安琪酵母菌發(fā)酵法制備貴州產(chǎn)刺梨果渣多糖的工藝條件，即為菌種的接種量3%、初始pH 值為4、發(fā)酵溫度32.5 ℃的條件下培養(yǎng)84 h。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，對還原能力和DPPH 自由基的清除率隨著貴州產(chǎn)的刺梨果渣多糖濃度的增大而逐漸升高，并且發(fā)酵法制備的多糖其抗氧化能力強(qiáng)于多糖原液，說明經(jīng)過發(fā)酵可以提高體外抗氧化活性，從而為果渣多糖的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供了依據(jù)。因此刺梨果渣發(fā)酵制備多糖作為天然抗氧化劑或膳食添加劑的開發(fā)使用，不僅緩解了資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染，而且制備工藝簡單、成本低廉，對于刺梨果渣等果蔬加工副產(chǎn)物的綜合開發(fā)及新型食品的研制有著一定的應(yīng)用價(jià)值。