由璐，趙艷雪，隋茜茜，劉素穩(wěn)，李鳳英，常學東

（河北科技師范學院食品科技學院，河北 秦皇島 066604）

歐李（Cerasus humilis（Bge.）Sok.）是我國特有的薔薇科櫻桃屬野生果樹，主要分布在北方部分省區(qū)[1]。其果實具有獨特的濃郁香氣，營養(yǎng)價值非常高，富含17 種氨基酸，VC，VB2，VE的總量以及 Ca，F(xiàn)e，Zn，Se 的含量均高于現(xiàn)有常見果品，其中鈣含量居水果榜首，又被譽為“鈣果”[2]。但由于歐李果實不易貯存保鮮，開發(fā)加工產(chǎn)品已成為歐李產(chǎn)業(yè)開發(fā)的必由之路。

多酚廣泛存在于果蔬組織中，有抗氧化和清除自由基功能，由于其在治療心腦血管疾病、預防癌癥以及抗衰老等方面有顯著功效，廣泛地應用于醫(yī)療和保健行業(yè)。歐李果含有較高抗氧化活性的酚類化合物，有極大的開發(fā)和利用價值[3]。以歐李果肉為原料，經(jīng)過發(fā)酵釀造的歐李果酒呈寶石紅色，酒香濃郁，酒體醇厚，余味綿長[4-5]，既能保留鮮果含有的大部分營養(yǎng)成分，又符合現(xiàn)代人追求健康、綠色、純天然的理念。歐李酒品質(zhì)中，顏色嚴重影響消費者的喜愛程度。花色苷是顏色的主要呈現(xiàn)物質(zhì)，因而花色苷含量是歐李酒品質(zhì)的一個重要指標。然而，果酒釀造過程中，由于微生物和溫度等的影響，顏色損失嚴重。有研究表明，水浴，超聲等預處理可提高果酒的品質(zhì)。董華強等[6]在超聲波處理強化楊桃酒的試驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲波可使香、味和酒體均有明顯改善。對山楂酒的水浴處理能顯著增加花色苷含量，增加酒體色度[7]。目前還沒有將預處理運用到歐李酒的報道，本試驗以歐李果為原料進行水浴、超聲波預處理，釀成果酒。對不同處理的歐李果酒在發(fā)酵后色調(diào)、色度等理化特性進行比較，分析酚類物質(zhì)的變化，從而進一步研究預處理對歐李酒抗氧化性的影響，為其應用提供有價值的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

歐李果：張家口六號，采自張家口壩上歐李果園。

果膠酶（≥1 000 U/mg）、福林酚試劑：上海源葉生物科技有限公司；白砂糖：市售，優(yōu)級；活性酵母ZYMAFLORE FX10：法國 LAFFORT 公司；蘆丁：國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；無水乙醇、鹽酸、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、乙酸、氯化鉀、抗壞血酸、結(jié)晶乙酸鈉（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SHA.B 型水浴恒溫振蕩器：常州金壇精達儀器制造有限公司；DHG-9245A 型鼓風干燥箱：上?；厶﹥x器制造有限公司；723 型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司制造；YP601 電子天平（準確度級別Ⅲ）：上海精密科學儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FG-118（BRIX/ATC）手持測糖儀：WD900B 型微波爐：順德市格蘭仕電器實業(yè)有限公司；JYL-C012 型九陽料理機：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

選取水浴、超聲波處理后花色苷含量最多的兩組以及對照組→打漿→調(diào)整成分（添加果膠酶、SO2、糖）→接種酵母→裝罐→發(fā)酵

1.3.2 工藝要點

1.3.2.1 釀造前工藝要點

挑選無病蟲害，無霉爛的歐李果，流動水清洗，備用。選用純凈水，與料液比1∶3（g/mL）進行攪碎。

1）對照組：未經(jīng)任何處理，測量花色苷含量。

2）水浴組：水浴組在 30、40、50、60、70 ℃進行處理，每個溫度間隔1 h 取樣進行測量，測量花色苷含量。

3）超聲波組：選用功率350 W，時間各為10、20、30、40 min 進行處理后取樣，測量花色苷含量。

以上各組取歐李果5 g，攪碎破爛，放入燒杯中加純凈水15 mL，再做處理。

1.3.2.2 釀造工藝要點

選取200 g 干凈無霉爛的歐李果，在預處理過后，加入果膠酶40 mg/L，攪拌均勻，放置24 h。加入SO280 mg/L 攪拌均勻，放置4 h 后再調(diào)糖。按照17 g/L 的糖生成1°酒，將歐李酒調(diào)成8°酒[8]。

活性干酵母的活化：添加量為0.2 g/L。在（35±1）℃取少許汁液進行活化，混勻輕攪后添加到歐李汁中，輕攪均勻[9]。當糖度不變發(fā)酵即結(jié)束。

在發(fā)酵 3、6、9 d 時取樣檢測。

1.3.3 理化性質(zhì)測定

1.3.3.1 糖度的測定

取適量歐李酒于已調(diào)零的測糖儀上進行測定，讀出示數(shù)并記錄[10]。

1.3.3.2 pH 值的測定

取歐李酒適量進行抽濾，用pH 計讀取pH 值，平行試驗 3 次，取平均值[11]。

1.3.3.3 色度、色調(diào)的測定

取歐李酒澄清液，用分光光度計在420、520、620 nm分別測其吸光度，以蒸餾水做空白。每個樣品重復測定 3 次取平均值[12]。

色度=A420nm+A520nm+A620nm

色調(diào)=A520nm/A420nm

1.3.4 酚類物質(zhì)的測定

1.3.4.1 花色苷的測定

1）緩沖溶液的配置：①pH4.5 的緩沖液的制備：取醋酸鈉18g，加冰醋酸9.8 mL，再加水稀釋至1 000 mL。②pH 1.0 的緩沖溶液的制備：稱取3.75 g 氯化鉀用純凈水溶解并定容至250 mL。量取4.25 mL 鹽酸用純凈水定容至200 mL，配成0.2 mol/L 鹽酸溶液，將KCl 溶液與HCl 溶液混合，用KCl 溶液調(diào)pH 值至1.0[13]。

2）歐李酒中花色苷的測定：分別取1 mL 歐李酒澄清液用pH1.0 和pH4.5 的緩沖溶液定容至10 mL，在700、520 nm 處測其吸光度，每個樣品重復測定3 次，取平均值[14-15]。

式中：A=（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；MW 為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子質(zhì)量；DF 為稀釋倍數(shù)；ε 為矢車菊素-3-葡萄糖苷消光系數(shù)（26900）；L 為比色皿光程。

1.3.4.2 多酚含量的測定

1）福林-酚法：稱取 0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 g 沒食子酸定容至50 mL，移液槍分別吸取0.1 mL于10 mL 的刻度試管中，隨后用移液槍吸取0.9 mL 純凈水加入試管中，同時依次加入5 mL 純凈水，1 mL 福林-酚顯色劑和3 mL 7.5%的NaCO3溶液，震蕩搖勻，避光條件下反應2 h 后，于765 nm 波長下測定吸光度[16]。以吸光度值為縱坐標，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制工作曲線得出標準方程：y=1.296x-0.000 2，R2=0.999 3。

2）樣品的測定：用移液槍準確吸取歐李酒澄清液0.2 mL，加去離子水至10 mL，即樣液稀釋50 倍，再按上述方法測定樣品的吸光度[17-18]。用回歸方程計算出樣品溶液中多酚的含量。

式中：W 為多酚含量（結(jié)果以歐李果含有相當于沒食子酸的毫克數(shù)表示）；C 為根據(jù)標準方程計算出待測液中多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為待測液體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；M 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 抗氧化能力測定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力

稱取0.003 9 g DPPH，用無水乙醇定容至100 mL，放容量瓶中備用，避光。

取1 mL 待測樣品與3 mL DPPH 溶液（0.1 mmol/L，無水乙醇配制）混合并充分搖勻，避光靜置30 min，然后在517 nm 處測定吸光度（A 樣品）。同時，以等量蒸餾水代替樣品作空白對照試驗（A 空白）。以樣品和無水乙醇混合液作為樣品調(diào)零，以蒸餾水和無水乙醇混合液作為空白對照調(diào)零[19-20]。DPPH 自由基清除率由下列公式計算得出：

DPPH 自由基清除率/%=（A 空白-A 樣品）/A 空白）×100

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力

1）將 7 mmol 的 ABTS 溶液和 2.45 mmol/L 的過硫酸鉀等體積混合，避光的條件下靜置過夜，形成ABTS+自由基儲備液，使用前用0.01 mol/L 的磷酸緩沖液pH=7.4 稀釋成工作液，使其在734 nm 下吸光度為0.70±0.02。

2）樣品的測定：吸取1 mL 待測樣品液與3 mL ABTS+自由基工作液，混合10 s 后在暗處準確反應6 min，在734 nm 波長下測定吸光度。同時以蒸餾水代替樣品做空白對照試驗，以樣品和蒸餾水混合液作為樣品調(diào)零，以4 mL 的蒸餾水為空白作為樣品調(diào)零[21-22]。ABTS+自由基清除率由下列公式計算出：

ABTS+自由基清除率/%=（A 空白-A 樣品）/A 空白×100

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李果預處理后花色苷含量測定結(jié)果

除對照組外，通過預處理選取出花色苷含量最高作為釀造歐李酒的最佳條件。水浴對歐李酒花色苷含量的影響見表1。

表1 水浴對歐李酒花色苷含量的影響Table 1 Anthocyanin content in Cerasus humilis wines of control group and water bath group

超聲波處理對歐李酒花色苷含量的影響見表2。

表2 超聲波處理對歐李酒花色苷含量的影響Table 2 Ultrasound group Cerasus humilis wines anthocyanin content

通過表1與表2可以確定出釀造歐李酒各組的最優(yōu)條件。在表1中可以看出，水浴組隨著溫度的升高，花色苷不斷溶出，所以提取量也增加，不同提取溫度之間歐李果酒花色苷提取量存在顯著性差異。溫度在50 ℃時花色苷含量達到最大，且顯著高于其他時間段（P＜0.05），但當溫度達到60 ℃時，花色苷含量開始下降。說明當提取時間繼續(xù)延長，會破壞花色苷的穩(wěn)定性，使其大部分開始降解，因此水浴組選擇50 ℃作為最佳條件。從表2中可以看出，隨著超聲波處理時間的延長，花色苷含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在處理30 min 時花色苷含量最高，但當時間超過30 min 后花色苷含量開始下降，說明花色苷結(jié)構(gòu)被破壞，或有其他物質(zhì)溶出，因此超聲波組選擇30 min 作為最佳條件。

2.2 理化性質(zhì)測定結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵過程中糖度的變化

糖度是表示糖液中固形物濃度的單位，工業(yè)上一般用白利度（°BX）表示糖度，指的是100 g 糖溶液中，所含固體物質(zhì)的溶解克數(shù)。隨發(fā)酵天數(shù)的增加，各組糖度變化情況見表3。

表3 不同處理方式對歐李酒糖度的影響Table 3 Three groups of Cerasus humilis wines sugar changes°BX

從表3可以看出，第0 天到第6 天3 組歐李酒酵母降糖速率比較緩慢，說明此時酵母正在大量的繁殖階段。從第6 天開始糖度大幅度下降，說明此時酵母已經(jīng)過對數(shù)生長期進入了穩(wěn)定期開始主發(fā)酵。

2.2.2 不同處理對歐李酒pH 值的影響

果酒中的酸類物質(zhì)主要來自于兩個部分：原料自帶，發(fā)酵產(chǎn)生。其中反映酸度的指標為pH 值，pH 值越小，酸度越高。當果酒中酸度在一定范圍時，可以良好的抑制雜菌的滋生、賦予果酒良好的風味。因此通過控制發(fā)酵過程中果酒的pH 值，來保證果酒的品質(zhì)。酵母菌最適pH 值為4.5～5.0，但為了防止雜菌污染，多控制在3.5～4.5。不同處理方式對歐李酒pH 的影響見表4。

由表4看出，超聲波和水浴處理對歐李酒pH 值影響都較小，均集中在一定的范圍內(nèi)波動，整個發(fā)酵過程中pH 值都維持在3.2～4.2 之間。各組在發(fā)酵期間0～6 d 內(nèi)pH 值變化相對較大，從第6 天開始pH 值變化較小，但依然在降低。

表4 不同處理方式對歐李酒pH 值的影響Table 4 The effect of different treatments on the pH value of Cerasus humilis wines

2.2.3 發(fā)酵過程中色度的變化

色度是評價果酒外觀質(zhì)量的一個重要指標，根據(jù)果酒的色度和色調(diào)，可判斷歐李酒的氧化程度和品質(zhì)好壞[23]。不同處理方式對歐李酒色度值的影響見圖1。

圖1 不同處理方式對歐李酒色度值的影響Fig.1 Effect of different processes on the chromaticity value of Cerasus humilis wines

由圖1可以看出，在整個發(fā)酵期間色度呈下降趨勢，這表明顯色物質(zhì)的總量在減少，發(fā)酵12 d 時，超聲波方式處理的酒樣色度值高于水浴組（P＜0.05），與對照組沒有顯著性差異。在發(fā)酵過程中，處理方式不同色度損失的情況也不同，歐李果酒的色度主要由酚類物質(zhì)花色苷、丹寧含量決定，同時也受樣液pH 值等的影響。

2.2.4 發(fā)酵過程中色調(diào)的變化

不同處理方式對歐李酒色調(diào)值的影響見圖2。

由圖2中可以看出發(fā)酵過程中色調(diào)的變化結(jié)果，色調(diào)主要是反映各顏色間的變化、轉(zhuǎn)移情況[24]。在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長色調(diào)值大體上呈下降趨勢，到發(fā)酵第12 天時，超聲波組色調(diào)值較高，但3 種處理方式間無顯著差異（P＞0.05）。色調(diào)值的變化部分與花色苷的降解有關，易導致歐李酒失去顏色。

2.3 酚類物質(zhì)的變化

2.3.1 花色苷含量的變化

不同處理方式對歐李酒花色苷含量的影響見圖3。

圖2 不同處理方式對歐李酒色調(diào)值的影響Fig.2 Effect of different processes on the tonality value of Cerasus humilis wines

圖3 不同處理方式對歐李酒花色苷含量的影響Fig.3 Effect of different treatments on anthocyanin content of Cerasus humilis wines

由圖3可知，經(jīng)3 種處理后的歐李酒，花色苷含量均隨發(fā)酵時間的延長持續(xù)下降，均在發(fā)酵開始時達到最高值，這是由于隨發(fā)酵天數(shù)的延長，花色苷受光照、pH 值、酶、糖及其降解產(chǎn)物等因素影響，所以含量逐漸減少。發(fā)酵第12 天時，對照組中花色苷含量為9.85 μg/mL，僅為對照組最高點的57.27%；水浴組中花色苷含量為16.59 μg/mL，為水浴組最高點的78.25%；超聲波組中花色苷含量為17.26 μg/mL，為超聲波組最高點的79.81%，經(jīng)水浴和超聲波預處理后花色苷含量均顯著高于未處理酒樣（P＜0.05）。有研究表明，酵母在生長發(fā)酵期間對花色苷進行了降解轉(zhuǎn)化，使花色苷含量逐漸減少，花色苷的降解還與酵母在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶和發(fā)酵后期酚類物質(zhì)氧化有關[25]。

2.3.2 多酚含量的變化

不同處理方式對歐李酒花多酚含量的影響見圖4。

圖4 不同處理方式對歐李酒花多酚含量的影響Fig.4 Effect of different treatment methods on polyphenol content in Cerasus humilis wines

多酚有抗氧化活性，能夠抗輻射和衰老。程霜等[26]對歐李中的多酚類活性物質(zhì)進行提取分離及性能評價，發(fā)現(xiàn)歐李中所含的相關多酚復合物有一定的自由基清除能力和抗氧化作用。圖4中給出了歐李果酒發(fā)酵過程中多酚含量的變化過程。在發(fā)酵1 d～6 d 期間，3種處理下的多酚含量呈上升趨勢。其中對照組多酚含量從 15.77 μg/mL 增長至 24.84 μg/mL、水浴組多酚含量從 18.43 μg/mL 增長至 25.26 μg/mL、超聲波組多酚含量從 21.17 μg/mL 增長至 26.28 μg/mL，且顯著高于對照組（P＜0.05）。原因可能是隨著發(fā)酵的進行，酚類物質(zhì)溶出，使發(fā)酵液中的濃度增大。在發(fā)酵第12 天時，對照組多酚含量降為20.22 μg/mL，比前6 d 降低了0.19%，水浴組多酚含量變?yōu)?2.73 μg/mL，比前6 d 的時候降低了0.1%，超聲波組多酚含量為24.09 μg/mL，比前6 d 降低了0.08%。

2.4 抗氧化結(jié)果測定

2.4.1 發(fā)酵過程中DPPH 自由基清除率變化

DPPH 自由基清除法是傳統(tǒng)的抗氧化能力測定方法之一，廣泛用于抗氧化物質(zhì)自由基清除能力的測定[27-28]。自由基通常都不穩(wěn)定，通過測定自由基清除力可以對抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性進行評價，自由基清除力會因測定對象的不同而得到不一樣的結(jié)果。不同處理方式對歐李酒DPPH 自由基清除率的影響見圖5。

由圖5可知，DPPH 自由基清除率總體呈現(xiàn)先微弱上升后下降的趨勢，與發(fā)酵過程中多酚含量變化趨勢較符合。發(fā)酵前、中期，DPPH 自由基清除率緩慢上升，這是由于發(fā)酵速率較快，歐李果產(chǎn)生大量汁液，使得抗氧化性物質(zhì)含量增加。發(fā)酵后期，由于酶的大量產(chǎn)生，酚類等大分子物質(zhì)被大量分解，因此抗氧化性降低，從而導致DPPH 自由基清除率緩慢下降。

圖5 不同處理方式對歐李酒DPPH 自由基清除率的影響Fig.5 Effects of different treatment methods on free radical clearance of Cerasus humilis wines by DPPH

2.4.2 發(fā)酵過程中ABTS＋自由基清除率變化

不同處理方式對歐李酒ABTS＋自由基清除率的影響見圖6。

圖6 不同處理方式對歐李酒ABTS＋自由基清除率的影響Fig.6 Effects of different treatment methods on free radical clearance of Cerasus humilis wines by ABTS+

利用ABTS＋自由基測定法來對提取物進行抗氧化活性的測量，能夠避免植物提取物的自吸收，其主要原因是ABTS＋自由基的最大吸收波長位于734 nm。由圖6可知，ABTS＋自由基清除率與DPPH 自由基清除率趨勢變化幾近相同，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。由于發(fā)酵中酚類物質(zhì)會產(chǎn)生解離和聚合的復雜反應，且這些反應與溫度、時間等多種因素有關，因此歐李果酒中多酚含量與ABTS＋自由基清除率呈正相關，此結(jié)論與焦揚等的研究結(jié)果一致[29]。

2.4.3 歐李酒多酚含量與抗氧化活性的相關性分析

歐李酒多酚含量與抗氧化活性的相關性分析見圖7。

由圖7可知，各組歐李酒的DPPH、ABTS＋自由基清除率與多酚含量均極顯著正相關（P＜0.01），且相關系數(shù)分別為0.950 和0.958。尚紅梅等[30]考察菊苣根多酚含量與抗氧化性能比較分析中，均發(fā)現(xiàn)受試樣品中多酚含量與DPPH 自由基、ABTS＋自由基清除能力間呈顯著正相關。前人大量研究也均表明，植物中的酚類物質(zhì)具有很好的抗氧化性[31-32]，能有效地清除多種自由基，從而發(fā)揮預防和輔助治療人類多種疾病的功能。試驗結(jié)果表明，經(jīng)過預處理的歐李酒抗氧化活性能力與它所含的多酚含量顯著相關。

圖7 歐李酒多酚含量與抗氧化活性的相關性分析Fig.7 Correlation analysis between polyphenol content and antioxidant activities of Cerasus humilis wines

3 結(jié)論

本試驗研究了經(jīng)預處理后的歐李酒在發(fā)酵期間花色苷、多酚、色澤及抗氧化活性的變化情況，并對結(jié)果進行了相關性分析，獲得以下主要結(jié)論：歐李酒主發(fā)酵期間，酒液糖度、pH 值、色度、色調(diào)、花色苷含量呈下降趨勢。多酚和抗氧化能力均呈先增加后降低。不同方式處理下的歐李酒均具有較強的抗氧化性，綜合了多酚含量及抗氧化活性的相關信息，表明經(jīng)預處理的歐李酒品質(zhì)和抗氧化性都要優(yōu)于未處理的歐李酒，為更進一步開發(fā)高品質(zhì)的歐李果酒提供了可行途徑。