王留成，劉 潔，高佳敏，孟丹陽，姚 彤，孫天驊，高寶嘉

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北保定 071000)

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一種普遍存在的桿狀芽孢桿菌，自1996年美國首次將轉(zhuǎn)Bt殺蟲蛋白基因作物商業(yè)化以來，在世界范圍內(nèi)迅速用作許多害蟲的防范措施[1]，Bt生物農(nóng)藥和轉(zhuǎn)Bt基因作物大大提高了人們有效安全地管理農(nóng)業(yè)害蟲的能力，但是由于受Bt毒素強(qiáng)烈的時(shí)間和空間選擇壓力，多種鱗翅目害蟲已經(jīng)產(chǎn)生抗性[2-3]，昆蟲對(duì)Bt的抗性已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因作物最主要的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，也是Bt作物持續(xù)長期有效的最大威脅[4-5]。

在全球范圍內(nèi)，已有大約17種昆蟲在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)Bt產(chǎn)生抗性，1種在田間表現(xiàn)出廣泛的抗性，8個(gè)國家進(jìn)行77項(xiàng)研究得出結(jié)論，由于更廣泛的監(jiān)測、Bt作物種植面積的增加以及暴露于Bt作物的害蟲種群數(shù)量和累積暴露時(shí)間的上升，到2010年，13種主要害蟲中有5種與Bt作物的田間進(jìn)化抗性有關(guān)，其中有4種是毛蟲，而2005年只有1種與Bt作物有關(guān)[6]。國內(nèi)近年來也有諸多相關(guān)報(bào)道，如梁革梅等[7]通過室內(nèi)篩選棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)16代后對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因棉的抗性上升43.3倍；楊峰山等[8]研究表明，小菜蛾(Plutellaxylostell)的Bt抗性品系在繁殖能力上存在顯著的生存劣勢；而陳建[9]以含Bt飼料飼養(yǎng)甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)后認(rèn)為，低濃度Bt對(duì)幼蟲存活、生長發(fā)育和繁殖均未造成影響，甚至對(duì)成蟲生殖有一定的促進(jìn)作用；賀明霞等[10]也發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)在不斷提高的汰選壓下其種群對(duì)Cry1Ie毒素的敏感性逐漸下降。這些昆蟲與轉(zhuǎn)基因作物的交互抗性研究為今后合理實(shí)施害蟲抗性治理策略提供了重要依據(jù)。

在林業(yè)中昆蟲與Bt交互抗性的研究主要是通過鱗翅目害蟲的短期脅迫反應(yīng)來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因楊的抗蟲性，如康薇[11]分析‘中嘉8號(hào)’轉(zhuǎn)Bt基因楊的田間抗性及生物安全性，鄭均寶等[12]、張炬紅等[13]及王智等[14]分析轉(zhuǎn)雙抗蟲基因‘741’楊(BtCry1Ac+API)的抗蟲性，均表明轉(zhuǎn)基因楊對(duì)靶標(biāo)害蟲具有良好的抗蟲性。但劉軍俠等[15]與宋曉英[16]基于SSR分析發(fā)現(xiàn)楊扇舟蛾(Closteraanachoreta)實(shí)驗(yàn)種群取食轉(zhuǎn)基因楊后其遺傳多樣性有明顯增高趨勢，這些研究對(duì)轉(zhuǎn)基因楊的可持續(xù)利用具有重要意義。而楊扇舟蛾是危害楊樹生長期的主要食葉害蟲，其1a可發(fā)生4～5代，產(chǎn)卵量大，蟲口數(shù)量易在短期劇增，可將整株楊樹的樹葉吃光，在中國華北、東北及西北地區(qū)都有不同程度的蟲災(zāi)發(fā)生[17-18]，嚴(yán)重危害當(dāng)?shù)厣仲Y源和生態(tài)安全。因此林業(yè)害蟲在Bt脅迫下其連續(xù)世代生長發(fā)育的變化同樣值得探討。本試驗(yàn)以楊扇舟蛾為例，連續(xù)3代對(duì)其飼喂轉(zhuǎn)基因‘Pb29’楊葉片及浸泡Cry1Ac殺蟲蛋白原毒素的楊樹葉片，明確Bt對(duì)楊扇舟蛾的長期殺蟲活性與控制效果，發(fā)現(xiàn)昆蟲對(duì)Bt的抗性產(chǎn)生規(guī)律和機(jī)制，為Bt的長期有效性、防止或延緩Bt抗性昆蟲種群的發(fā)展提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與蟲源

非轉(zhuǎn)基因毛白楊無性系‘741’楊[Populusalba×(P.davidiana+P.simonii)]×P.tomentosa選自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園；轉(zhuǎn)基因‘741’楊高抗品系‘Pb29’為田穎川[19-20]、鄭鈞寶等[12]培育的轉(zhuǎn)雙抗蟲基因[Bt殺蟲蛋白基因(BtCry1Ac)+慈菇蛋白酶抑制基因(API)]無性系，選自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園。采摘枝條中部的健康、新鮮葉片飼喂幼蟲。

供試楊扇舟蛾幼蟲及卵塊采自河北省保定市郊區(qū)非轉(zhuǎn)基因楊人工純林，由于野采幼蟲部分有寄生蜂寄生及雜菌感染，因此在養(yǎng)蟲室用對(duì)照741楊樹葉片培養(yǎng)F1代至羽化，隨機(jī)交配產(chǎn)F2代孵化成幼蟲，正常葉片飼養(yǎng)，3齡后用于試驗(yàn)。

所用BtCry1Ac原毒素購于北京美延農(nóng)業(yè)科技有限公司，試驗(yàn)期間避免強(qiáng)烈陽光直射。

1.2 樣品處理及昆蟲飼養(yǎng)

‘741’楊和轉(zhuǎn)基因‘Pb29’楊葉片處理前用蒸餾水清洗晾干。將BtCry1Ac原毒素以50 mmol/L的Na2CO3溶液稀釋，配成系列質(zhì)量濃度，依次為A=15 μg/mL、B=7.5 μg/mL、C= 1.5 μg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。將新鮮干凈的‘741’楊葉片在各梯度藥液中浸泡10 s后保鮮自然晾干；‘Pb29’楊葉片不做處理，設(shè)為P組，經(jīng)檢測其Bt表達(dá)量低于C組；以50 mmol/L Na2CO3溶液作為對(duì)照組(CK)。各處理葉片用花泥保濕，移入高為12.0 cm，直徑為8.5 cm的罐頭瓶中。

所有楊扇舟蛾均于養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)，條件： 26 ℃±1 ℃，相對(duì)濕度60%～75%，光周期 16L∶8D。將生長狀態(tài)一致的3齡幼蟲接到葉片上，250目紗網(wǎng)封口，每處理接幼蟲20頭，3次重復(fù)，每天更換新鮮的處理后的楊樹葉。各處理Bt脅迫6 d后全部飼喂正常的非轉(zhuǎn)基因‘741’楊樹葉片，視幼蟲數(shù)量適時(shí)分瓶，直至幼蟲老熟化蛹，羽化后各組分別轉(zhuǎn)入直徑28 cm、高32 cm、120目尼龍網(wǎng)的養(yǎng)蟲籠中，并以稀釋100倍的蜂蜜水供其取食，自由交配產(chǎn)卵。相同方法連續(xù)飼養(yǎng)3代，記錄幼蟲的死亡率、發(fā)育歷期、化蛹率，蛹質(zhì)量及成蟲的羽化率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)”表示，處理間不同參數(shù)(百分率指標(biāo)以反正弦處理)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)一致且服從正態(tài)分布，并采用SNK檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析；回歸分析采用線性回歸；蛹質(zhì)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析法進(jìn)行代間比較，經(jīng)箱式圖檢驗(yàn)無異常值，經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)服從正態(tài)分布(P>0.05)，經(jīng)Mauchly’s球形假設(shè)檢驗(yàn)，因變量的方差協(xié)方差矩陣相等(P> 0.05)，不相等的(P<0.05)通過Greenhouse-Geisser方法校正。數(shù)據(jù)均以SPSS 19.0計(jì)算所得，以O(shè)ffice Excel 2016為輔助工具。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度Cry1Ac對(duì)楊扇舟蛾連續(xù)世代存活的影響

2.1.1 幼蟲8 d死亡率 幼蟲取食含Bt樹葉 6 d后，Bt在隨后兩天里仍會(huì)發(fā)揮作用，故統(tǒng)計(jì)幼蟲的8 d死亡率表明，第1代各處理下Bt對(duì)楊扇舟蛾的短期致死效果存在顯著差異(P<0.05)，死亡率隨著葉片中Cry1Ac質(zhì)量濃度的升高而顯著升高(P<0.05)(表1)，其中A組的死亡率達(dá) 83.4%，顯著高于C組的低質(zhì)量濃度處理(P< 0.05)；第2代差異性與第1代類似，A、B、C組的死亡率比第1代均有下降，雖然C組仍然比CK高，但已無顯著性差異(P>0.05)；第3代中A組死亡率與前兩代相比下降明顯，且B組、C組及P組與CK之間差異不顯著(P>0.05)，可見Bt對(duì)楊扇舟蛾連續(xù)世代的短期致死效果出現(xiàn)減弱的趨勢。

2.1.2 楊扇舟蛾每代存活率 楊扇舟蛾幼蟲的存活曲線表明，幼蟲取食含Bt樹葉后1～2 d內(nèi)并沒有出現(xiàn)明顯的死亡現(xiàn)象(圖1)，這是由于楊扇舟蛾幼蟲體內(nèi)的BtCry1Ac毒蛋白與中腸受體結(jié)合，毒蛋白插入膜內(nèi)形成孔洞需要一定的響應(yīng)時(shí)間，至幼蟲死亡則需要2～3 d。從第4天開始各處理均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，且在停止Bt脅迫后的9～13 d內(nèi)幼蟲仍受到其影響，各組存活率不斷下降，其中第1代及第2代與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，P組存活率在B組與C組之間，第13天后各組逐漸趨于穩(wěn)定；從幼蟲化蛹前的校正存活率來看(表2)，A組高濃度Bt處理對(duì)連續(xù)3代楊扇舟蛾幼蟲的長期抑制效果沒有出現(xiàn)明顯減弱，但隨著世代的延續(xù)其他各組存活率開始升高，且各處理間差異在逐漸縮小(圖1-b,1-c)，養(yǎng)蟲試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，10～17 d死亡的幼蟲大部分發(fā)育遲緩，無法蛻皮，齡期長期停留在3齡，并且從3代存活曲線的平臺(tái)期越來越明顯可以看出，這部分幼蟲取食正常葉片仍不能完成整個(gè)生命歷程，但幼蟲的死亡速度逐漸減緩，對(duì)Bt的耐受性在逐漸增強(qiáng)，其中B組最為明顯，到第3代存活率為 86.7%，與對(duì)照相當(dāng)。

表1 不同質(zhì)量濃度Cry1Ac飼養(yǎng)楊扇舟蛾 3代的8天幼蟲死亡率Table 1 Mortality of Clostera anachoreta larvae dieting with different mass concentrations of Cry1Ac toxin 8 days for three generations

注：同列中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Values within a column followed by different letters are significantly different(P<0.05).The same below.

a.第1代 The first generation；b.第2代 The second generation；c.第3代 The third generation

2.2 不同質(zhì)量濃度Cry1Ac對(duì)連續(xù)世代楊扇舟蛾發(fā)育歷期的影響

楊扇舟蛾連續(xù)世代各齡期變化表明(表3)，初孵幼蟲在無Bt脅迫下齡期均為4 d左右，且每代差異均不顯著(P>0.05)；通過1～3代的3齡發(fā)育時(shí)間對(duì)比，3齡中期開始脅迫后隨著質(zhì)量濃度升高各組齡期也隨之明顯延長，且每代的A組均與其他處理差異顯著(P<0.05)，A組第1代有的幼蟲處于3齡期長達(dá)23 d，而第2、3代低質(zhì)量濃度處理的部分幼蟲已經(jīng)在停止Bt脅迫末期能蛻皮到達(dá)4齡；從高齡期數(shù)據(jù)可以看出，第1代各處理四齡均比對(duì)照長，Bt對(duì)幼蟲發(fā)育及蛻皮速度影響明顯，但第2、3代高齡幼蟲已基本與對(duì)照無顯著差異(P>0.05)；各世代對(duì)比表明，雖然每代齡期比上代有所縮短，但相同處理的每代間發(fā)育時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

整個(gè)幼蟲歷期的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(圖2)，3種質(zhì)量濃度的BtCry1Ac及轉(zhuǎn)基因‘Pb29’楊均使楊扇舟蛾幼蟲的發(fā)育速度顯著減慢，歷期延長(P< 0.05)，其中對(duì)照組的發(fā)育歷期最短，第1代 15.12 d、第2代14.51 d、第3代12.73 d，且每代發(fā)育速度比前一代有少量加快；A組各代歷期分別為29.19、27.13、29.33 d，較對(duì)照分別延長 14.07、12.62、16.44 d，從表3可知主要是由于幼蟲長期停留在3齡所致；P組所喂葉片Bt質(zhì)量濃度雖然比C組低，但第1、2代歷期反而比C組長；B組各代歷期為24.47、21.87、14.42 d，第3代有較大縮短，C組每代歷期也均有縮短(24.47、21.87、19.52 d)，但B組第3代與對(duì)照無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同質(zhì)量濃度Cry1Ac飼養(yǎng)楊扇舟蛾幼蟲 3代的校正存活率Table 2 Corrected survival rate of Clostera anachoreta larvae after they were dieting with different mass concentrations of Cry1Ac toxin for three generations

注：校正存活率=(處理存活率-對(duì)照存活率)/(1-對(duì)照存活率)×100%。

Note:Corrected survival rate=(Treatment survival rate-Control survival rate)/(1-Control survival rate)×100%.

2.3 不同質(zhì)量濃度Cry1Ac對(duì)連續(xù)3代楊扇舟蛾蛹質(zhì)量的影響

由圖3可知，Bt脅迫下第1代幼蟲的蛹質(zhì)量受到嚴(yán)重影響，其隨著Cry1Ac殺蟲蛋白質(zhì)量濃度的升高而出現(xiàn)明顯減輕，對(duì)照組的蛹渾圓飽滿，A組與B組的蛹細(xì)小瘦弱，僅有100多 mg，C組與P組較對(duì)照也有極大減輕。通過重復(fù)測量方差分析法所得結(jié)果如下。

A組3代蛹質(zhì)量分別為(134.57±12.17) mg、(207.76±11.61) mg和(220.28±18.56) mg，各代蛹質(zhì)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)(2,4)=28.861，P= 0.004，偏η2=0.935，第2代蛹質(zhì)量比第1代顯著升高73.190 mg(95%置信區(qū)間：29.373～117.007，P=0.018)，第3代與第2代(P=1.000)、第3代與第1代(P=0.051)差異不顯著。

B組分別為(138.57±13.56) mg、(234.14± 9.53) mg和(403.88±48.73) mg，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)(2,4)=72.962，P=0.001，偏η2= 0.973，第2代蛹質(zhì)量比第1代顯著升高95.567 mg(95%置信區(qū)間：38.206～152.927，P= 0.018)，第3代比第1代顯著升高265.310 mg(95%置信區(qū)間：38.802～491.818，P=0.037)，第3代與第2代(P=0.056)差異不顯著。

C組分別為(163.33±15.54) mg、(251.98± 15.55) mg和(294.40±31.98) mg，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)(2,4)=37.302，P=0.003，偏η2= 0.949，第2代蛹質(zhì)量比第1代顯著升高88.650 mg(95%置信區(qū)間：42.597～134.703，P= 0.014)，第3代比第1代顯著升高131.073 mg(95%置信區(qū)間：14.155～247.992，P=0.040)，第3代與第2代(P=0.550)差異不顯著。

表3 不同質(zhì)量濃度Cry1Ac飼養(yǎng)楊扇舟蛾3代的齡期Table 3 Instar of Clostera anachoreta larvae dieting with different mass concentrations of Cry1Ac toxin for three generations

P組分別為(176.99±16.51) mg、(269.63± 10.53) mg和(315.11±62.86) mg，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)(2,4)=13.456，P=0.017，偏η2= 0.871，第2代蛹質(zhì)量比第1代顯著升高92.633 mg(95%置信區(qū)間：60.920～124.347，P= 0.006)，第3代與第2代(P=0.960)、第3代與第1代(P=0.144)差異不顯著。

CK組分別為(248.06±8.14) mg、(287.90± 12.99) mg和(400.53±32.34) mg，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)(2,4)=34.347，P=0.003，偏η2= 0.945，但第2代與第1代(P=0.217)、第3代與第2代(P=0.125)、第3代與第1代(P=0.051)差異均不顯著。

把世代設(shè)為x，各處理平均蛹質(zhì)量設(shè)為y后(圖3)，其線性回歸方程分別為：

A：y=42.853x+101.83，R2=0.856 9

B：y=132.65x-6.444 6，R2=0.974 6

C：y=65.537x+105.5，R2=0.960 2

P：y=69.06x+115.79，R2=0.962 6

CK：y=76.235x+159.69，R2=0.929 4

圖中所列數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示相同處理的不同世代之間差異顯著(P<0.05，SNK法檢驗(yàn))。下同 The data shown in the figure are average±standard deviation.Different letters indicate significant differences among different generations of the same treatment(P<0.05,SNK test).The same below

圖2 楊扇舟蛾幼蟲連續(xù)取食Cry1Ac葉片的3代幼蟲歷期
Fig.2 Laval duration of three successive generationsofClosteraanachoretalarvae dietingwith the leaves of Cry1Ac

可見各組蛹質(zhì)量隨著世代延續(xù)均有升高趨勢且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中A、B、C、P組的第2代比第1代顯著升高(P<0.05)，但第3代比第2代均無顯著性差異(P>0.05)，且CK組各世代間均無差異性(P>0.05)，推測世代對(duì)蛹質(zhì)量的影響在逐漸減弱；回歸分析發(fā)現(xiàn)處理與對(duì)照間的差距在不斷縮小，A組增幅最小，Bt連續(xù)3代對(duì)其化蛹均有較強(qiáng)的抑制效果；而B組中質(zhì)量濃度處理增幅反而最高，從亞致死劑量的B組存活下來的高齡老熟幼蟲有著比CK還要強(qiáng)的營養(yǎng)積累能力；低質(zhì)量濃度C組的蛹質(zhì)量反而低于B組和P組。以上表明即使Cry1Ac對(duì)幼蟲前期有較大影響，停止脅迫后存活并發(fā)育到高齡期的幼蟲仍然能夠攝取到足夠的營養(yǎng)完成化蛹，且隨著世代的延續(xù)蛹質(zhì)量也在不斷增加，但不同梯度處理間并沒有線性差異。

圖3 不同質(zhì)量濃度Cry1Ac飼養(yǎng)下 楊扇舟蛾的蛹質(zhì)量Fig.3 Pupal mass of Clostera anachoreta larvae dieting with different mass concentrations of Cry1Ac toxin

2.4 不同質(zhì)量濃度Cry1Ac對(duì)連續(xù)3代楊扇舟蛾化蛹率及羽化率的影響

盡管幼蟲化蛹率隨葉片中Cry1Ac殺蟲蛋白質(zhì)量濃度的升高而下降，由于轉(zhuǎn)移至正常葉片上存活下來的高齡幼蟲大部分均能發(fā)育至蛹，而處理組幼蟲死亡導(dǎo)致化蛹基數(shù)有一定減少，所以化蛹率與死亡率趨勢及差異性相似(表4)；羽化率的計(jì)算以最終成蛹量為基數(shù)，即羽化的楊扇舟蛾數(shù)占蛹數(shù)的比例，各世代間羽化率隨Cry1Ac質(zhì)量濃度的升高有輕微波動(dòng)，處理較對(duì)照及世代間無顯著差異(P>0.05)。表明即使Cry1Ac殺蟲蛋白對(duì)3齡楊扇舟蛾幼蟲脅迫后，其各代幼蟲化蛹之后的羽化過程仍不受影響。

表4 不同質(zhì)量濃度Cry1Ac連續(xù)飼養(yǎng)楊扇 舟蛾3代化蛹率及羽化率的影響Table 4 Pupation and emergence of three successive generations of Clostera anachoreta larvae dieting with different mass concentrations of Cry1Ac toxin

3 討 論

3.1 楊扇舟蛾對(duì)Bt的抗性風(fēng)險(xiǎn)

通過分析不同質(zhì)量濃度Bt Cry1Ac脅迫對(duì)楊扇舟蛾連續(xù)3代存活率、發(fā)育歷期以及蛹質(zhì)量等指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，含Bt Cry1Ac殺蟲蛋白的葉片及轉(zhuǎn)基因‘Pb29’楊對(duì)3齡楊扇舟蛾有著較強(qiáng)的毒殺作用，高質(zhì)量濃度Bt對(duì)低齡幼蟲的致死效果隨著代數(shù)延長沒有明顯減弱，與高寶嘉等[21]的研究一致，也有報(bào)道楊扇舟蛾幼蟲取食轉(zhuǎn)基因‘741’楊兩代未產(chǎn)生抗性，且連續(xù)兩代脅迫后第2代死亡率高于第1代[13,22]，由此推測楊扇舟蛾初孵幼蟲很難在轉(zhuǎn)基因楊上完成世代發(fā)育。本研究幼蟲取食Bt葉片后發(fā)育受到抑制，第1代和第2代幼蟲歷期較對(duì)照組明顯延長，陳建[9]與張炬紅等[13]也有相似的研究結(jié)論，但停止脅迫后高齡幼蟲齡期基本不受影響，且死亡率降低，耐受性逐漸提高，因此如果取食非轉(zhuǎn)基因楊的高齡幼蟲轉(zhuǎn)移到Bt楊上取食后就有可能存活下來。

蛹質(zhì)量隨Cry1Ac質(zhì)量濃度的升高而顯著下降，同鐘勇等[23]研究結(jié)果相似，但本試驗(yàn)中蛹質(zhì)量隨著世代延長而穩(wěn)定回升，在亞致死劑量存活下來的老熟幼蟲比低質(zhì)量濃度處理幼蟲有著更強(qiáng)的耐受性，營養(yǎng)積累能力增強(qiáng)，可見低濃度的Bt處理無法激發(fā)幼蟲的響應(yīng)機(jī)制，反而在亞致死劑量脅迫下幼蟲會(huì)產(chǎn)生較明顯的適應(yīng)性。結(jié)合上文分析及本試驗(yàn)中較高的羽化率結(jié)果，由于轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)楊扇舟蛾實(shí)驗(yàn)種群深刻的遺傳分化影響[15-16]，野外楊扇舟蛾種群在不同寄主間取食與繁殖的世代延續(xù)過程中，可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因楊樹產(chǎn)生抗性的楊扇舟蛾種群。

此外，本試驗(yàn)所用‘Pb29’楊中轉(zhuǎn)了Bt和API兩種抗蟲基因，雖然其表達(dá)的Bt質(zhì)量濃度低于1.5 μg/mL，但由于存在API基因，增強(qiáng)了抗蟲效果，進(jìn)而影響取食‘Pb29’楊葉片的幼蟲齡期與發(fā)育歷期。而致死效果不穩(wěn)定可能是由于采取的多年生轉(zhuǎn)基因‘Pb29’楊葉片中Bt表達(dá)量不穩(wěn)定所致。另外處理組歷期縮短除了對(duì)Bt的適應(yīng)性逐漸加強(qiáng)的因素，也有可能還受野生楊扇舟蛾在室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)逐漸馴化及季節(jié)氣候變化的 影響。

3.2 多種高效管理策略的必要性

植物與昆蟲之間是不斷相互選擇、協(xié)同進(jìn)化的[24]。害蟲取食植物過程中，植物能夠產(chǎn)生多種次生性代謝產(chǎn)物影響害蟲的取食行為或生理反應(yīng)來抵御害蟲侵害，害蟲又能通過改變體內(nèi)酶的響應(yīng)機(jī)制等多種途徑不斷地適應(yīng)寄主植物的抗蟲性[25]，甚至食物中可溶性蛋白質(zhì)-可消化碳水化合物的含量都可以降低對(duì)Bt毒素的敏感性[26]，因此實(shí)施有效和高效的管理策略來控制蟲害爆發(fā)是非常具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樗蕾囉趯?duì)害蟲生物學(xué)和生態(tài)學(xué)的全面了解，以及預(yù)測加劇害蟲管理問題的變化趨勢[27]。為了延緩和管理田間害蟲對(duì)Bt作物的抗性，世界范圍內(nèi)應(yīng)用較為廣泛的有金字塔植物策略(在同一植物中表達(dá)不同的Cry基因)及高劑量/避難所策略，而自然避難所策略適用于具有高成蟲擴(kuò)散行為的多食性害蟲，對(duì)單食性或低分散性害蟲不適用[28]，而本研究中楊扇舟蛾對(duì)亞致死劑量的高度耐受性也證明世代種群對(duì)轉(zhuǎn)Bt植物抗性累積發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，因此在林業(yè)中開展種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測、金字塔植物及避難所策略等措施，從而防止或延緩Bt抗性昆蟲種群的產(chǎn)生。

4 結(jié) 論

楊扇舟蛾在不同質(zhì)量濃度Bt Cry1Ac及轉(zhuǎn)基因‘Pb29’楊脅迫下連續(xù)3代的發(fā)育指標(biāo)表明，含Bt Cry1Ac殺蟲蛋白的葉片及轉(zhuǎn)基因‘Pb29’楊對(duì)3齡楊扇舟蛾有著較強(qiáng)的毒殺作用，幼蟲取食Bt葉片后發(fā)育受到抑制，但隨世代延長對(duì)低質(zhì)量濃度Bt及轉(zhuǎn)基因‘Pb29’楊耐受性逐漸提高，且老熟幼蟲齡期不受影響；蛹質(zhì)量隨Cry1Ac質(zhì)量濃度升高顯著下降，但隨著世代延長而穩(wěn)定回升，而在亞致死劑量存活下來的老熟幼蟲比低質(zhì)量濃度處理幼蟲有更明顯的適應(yīng)性，增加楊扇舟蛾對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因楊樹的抗性風(fēng)險(xiǎn)。